微柱法利用微柱内介质的分子筛效应来区分凝集反应中游离红细胞和凝集红细胞的技术，Rh血型鉴定微柱中填充IgM类抗-D抗体试剂，用于检测红细胞上的D抗原。对于微柱法的鉴定结果，如对照孔和抗D孔均阴性，当检测机构为，即检测的标本是受血者时，即可认为是阴性，输注RhD阴性的红细胞。而当检测标本为献血者，则需考虑是否是真阴性，需进行确证实验来验证有无D变异型的存在，D变异型主要包括弱D（抗原数量减少，可能需要抗人球蛋白试验证明）、部分D（部分抗原表位缺失，可能与部分单克隆试剂不凝集）、Del（D抗原表达极少，需进行吸收放散）。基于输血安全，D变异型作为献血者需当作D阳性看待，作为受血者则应作为RhD阴性。如果对照孔是阳性，则说明存在干扰因素，如离心不充分等导致的血清中残留纤维蛋白原、被检红细胞发生自身凝集、标本被细菌污染或抗凝不完全、孵育温度不够导致红细胞穿孔困难等导致的假阳性，应在排除干扰因素后再进行检测。在操作时也要注意避免因操作因素导致的误差如抗原抗体比例不合适引起前带或后带现象、离心力过度使弱阳性表现为阴性等。试管法抗-D血型定型试剂在盐水介质里能同时与多个红细胞膜上的D抗原决定簇结合形成凝集，通过红细胞上存在或不存在D抗原来确定RhD血型。使用抗-D直接凝集试验检测红细胞上的D 抗原。试管法检测应注意使用IgM+IgG抗-D试剂检测受血者时，只能采用盐水法检测，不能采用间接抗人球蛋白法检测。对照管阳性可能是异常蛋白或自身抗体干扰所致，可以采用常温生理盐水洗涤、37℃温盐水洗涤或45℃震荡孵育和洗涤来消除干扰。此外，D阴性母亲的新生儿，发生新生儿溶血病，直接抗人球蛋白试验结果为阳性，其Rh血型可能因为母亲抗体的遮断现象导致假阴性结果，此时需要进行放散后再进行RhD血型鉴定。文章来源：微诊网，订阅若有侵权或转载限制请联系我们（或在公众下方留言），我们将时间联系您并进行删除。编辑：青翠欲滴
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阴性,红细胞,血型,抗原,检测
[] 目的:探讨进行ABO、RhD正反定型手工微柱法在血型鉴定中的应用。方法:对门诊送检血样同时采用手工微柱凝胶法及手工盐水试管和玻片法进行ABO、RhD正反对比定型鉴定。结果:一次性正确率,手工微柱凝胶法正定型为100%、反定型为99.92%;试管法分别达到99.92%、99.83%;玻片法正定型率正确率为98.91%。结论:手工微柱凝胶法操作简单、快速,易于观察。其灵敏度高于试管法与玻片法。血型标本便于保存,利于事后复查,值得在二甲以上推广。
[关键词] 微柱凝胶法;试管法;玻片法
[中图分类] R 457.1[文献标识码]B[文章编]1673-7210(2010)05(b)-159-02
在做ABO血型鉴定时,临床广泛应用的玻片法虽操作简单、方便快捷,但在临床实际工作中却时有发生血型鉴定错误现象,而且往往是在患者需要输血治疗申请配血时被发现错定血型,导致临床科对检验科产生不良印象,认为检验质量差,检验结果不准确、不可靠。对检验科工作会产生很大的负面影响。试管法是传统经典的ABO、RhD血型鉴定方法,其结果准确可靠,但与微柱凝胶法相比,敏感性较差,操作难以规范化、自动化、检测结果不易保存,而微柱凝胶法用于ABO、RhD血型鉴定易于自动化、标准化、结果准确可靠,特异性强等优点被许多大所采用。笔者在湘雅三院输血科进修学习期间,对于门诊每天送检血型鉴定标本同时采用手工微柱凝胶法鉴定ABO、RhD血型结果与试管和玻片法进行ABO、RhD血型鉴定结果进行比较。
1材料与方法
1.1材料
湖南省湘雅三院输血科2009年1月~2009年6月门诊血型鉴定1 193例,抽取静脉血1 ml用EDTA-K2抗凝,年龄1 d～90岁。
1.2试剂
ABO、RhD血型定型微柱凝胶试剂卡(单克隆抗体)(长春博迅生物技术有限责任公司提供)反定型用的A型标准试剂细胞、B型标准试剂细胞由本实验自制2%~5%试剂红细胞,按版临床输血手册[1]操作。
1.3设备
TD-3A型血型血清学专用离心机(长春博研科学仪器有限责任公司生产)
1.4 方法
对门诊送检血样同时采用手工微柱凝胶法及手工盐水试管法进行ABO、RhD正反定型鉴定。用玻片进行ABO、RhD正定型鉴定。
1.4.1 微柱凝胶法①正定型,将受检者0.5%的红细胞生理盐水悬液,加入抗A、抗B、抗D、阴性对照微管凝胶孔中,每孔50 μl即可使用微柱凝胶离心机,以900 r/min离心2 min;以1 500 r/min离心3 min,取出肉眼观察结果。②反定型,先将受检者血浆标本加注Ac、Bc 两孔内,每孔50 μl。后在2孔标本中分别加入相应的A型B型标准红细胞悬液50 μl即可使用微柱凝胶离心机,以900 r/min离心2 min,1 500 r/min离心3 min取出观察结果[2]。结果判定标准按试剂盒说明书。阳性:红细胞抗原与相应抗体在微柱凝胶中形成的特异性抗原抗体复合物浮在凝胶表面或胶中。反应强度:特异性红细胞抗原抗体复合物位于凝胶表面为强阳性反应,复合物在胶中为弱阳性反应;愈靠近胶底部颗粒愈小,反应愈弱。阴性:被检红细胞抗原无相应的抗体结合,不出现特异性抗原抗体复合物,红细胞沉于微柱凝胶的尖底部。
1.4.2 试管法①查抗原(正定型):取洁净小试管2支,分别标明抗A 、抗B,用滴管加入抗A和抗B分型试剂2滴于试管底部,再分别加入受检者5%红细胞盐水悬液1滴,混匀。②查抗体(反定型)取洁净小试管2支,分别标明A 型、B型细胞。用滴管加入受检者血清2滴于试管底部,再分别以滴管加入A、B型5%试剂红细胞悬液1滴,混匀与正定型2管,立即放入离心机内以1 000 r/min离心5 min。取出轻轻摇动试管,使沉于管底的红细胞浮起,以肉眼观察来判断结果[2]。
1.4.3 玻片法正定型取清洁玻片用蜡笔标明抗A、抗B,并加入抗A、抗B分型试剂各1滴于玻片标记相对应处,再以滴管分别加入受检者10%红细胞盐水悬液1滴充分混匀,连续约15 s以肉眼观察来判断结果[2]。
2 结果
在1 193例送检血样中,一次性正确率:微柱凝胶法正定型率100%、反定型率99.92%;试管法一次性正确率也分别达到99.92%、99.83%;玻片法一次性正确率为98.91%。这与张悦,张国平研究结果基本相符[3]。3种检测方法结果见表1、
表1 3种血型鉴定方法比较
3 讨论
在上述3种方法血型鉴定不符17例。对可疑结果及时进行复查其结果,①1例微柱凝胶法正反不符情况是:抗A(-)、抗B(4+)、A型(1+)、B型(3+),后经待检者的血清与已知血型的试剂红细胞即筛选红细胞(I、Ⅱ、Ⅲ套)起反应抗体筛查显阳性,表明有其他不规则抗体存在。后确定血型是“B”(已查到的抗原定型[2])。微柱凝胶法是应用分子排阻析原理,通过微小的凝胶颗粒构成的滤网,在离心条件下,将与抗体反应的红细胞浮于胶表面或胶中,将未与抗体反应的红细胞沉至微柱凝胶的尖底部。结果可以由自动化仪器判读,也可以由肉眼直视判读。目前国内一些大主要用该法进行ABO、RhD 血型抗原鉴定,该法有自动化和手工两种,三院输血科采用的是手工微柱凝胶法。②三例试管法正反不符多由操作繁琐易出现漏加、错加抗A 、抗B试剂或试剂红细胞悬液浓度度不够造成肉眼观察困难。③对于13例玻片法判断困难的可疑结果后经试管法和、微柱凝胶法复查证实有8例定型错误。这可能由亚型红细胞抗原与抗体的凝集反应慢、凝集强度弱,而造成误判。此外还有一些疾病,如白血病、恶性肿瘤也会使RBC抗原变弱;而某些自身免疫性疾病或新生儿溶血患者的RBC会发生自发性凝集[4]。有时还可因为红细胞浓度过高或低,以及玻片、吸管、试管等污染造成假凝集,引起血型鉴定错误[5-6]。
本研究表明,手工微柱凝胶免疫检测ABO、RhD 血型鉴定,其灵敏度、准确性均与试管法一致,其反应强度高于试管法、优于玻片法。微柱凝胶法操作简便、快速、省时、省力,易于观察结果,并可以长时间保存血型鉴定样本(保存7 d以上),有利于事后复查。该法样本、试剂用量少,结果的判读易于标准化,更大限度减少了操作者主观因素的影响。玻片法正定型虽操作简单、方便快捷被广泛应用于临床,可在操作时,是一块玻片只能做一个人,做血型鉴定一个一个做,如标本量大时就不便于操作,费时费力。在实际工作中很少同时做反定型,由于没有指控(反定型),如遇弱凝集、冷凝集、或假凝集时容易对结果误判出错,而不能及时发现。再有,做过的玻片放置时间稍长就会因液体挥发而凝集也给审核签发人员(主管检验师)带来不便。为确保血型鉴定的准确性,避免血型差错。建议手工微柱凝胶法血型鉴定技术应在二甲以上推广使用。考虑到微柱凝胶法成本略高的关系,对门诊用可采用试管法、而对住院患者则采用手工微柱凝胶法分步实施的办法。
[参考文献]
[1]王宝燕。输血手册[M]。北京:科学出版社,2008:129-132、
[2]夏琳。临床输血诊疗技术[M]。北京:人民卫生出版社,2008:62-64、
[3]张悦,张国平。ABO血型2种检测方法比较[J]。职业与健康,2008,24(14):1393-1397、
[4]王琳。抗M引起ABO血型鉴定困难分析[J]。国内现代,2009,47(2):91、
[5]陈希元。 ABO血型鉴定中应注意的问题及解决方法[J]。社区医学杂志,2009,7(2):39、
[6]余海燕,王席,丁后明。高效价冷凝集素患者引起的血型鉴定困难1例报道[J]。国内现代,2008,46(22):130、
(收稿日期:)
寿阳县人民
输血科指导作业书
主题内容
ABO Rh(D)
血型鉴定操作规程
文
件
编
：
SX-PF-001
版本：
A/O
生效日期：
页码：第
页，共
4
ABO Rh(D)
血型鉴定（微住凝胶法）
【产品名称】
通用名称：
ABO
、
RhD
血型检测卡（微注柱胶）
包装規格】
12
卡／盒（货：
BX1002
【预期用途】
本品用于人
ABO
、
RhD
血型抗原的检测，只用于临床检測，不用于血源筛查
血型检测主要应用于输血。当人身体内循环血量不足或大失血时，輸血是挽教患者生命的
重
要医疗措施。输血的前提是必须选择血型相同的供血者，进行交又配血相合时才能输血
对于
RhD
阴性结果应按有关规定做进一步的确认试验，必要时送血型参比实验进行确认
实
【检验原理）
本品应用了微柱凝胶免疫技术，采用排阻析原理，即在微柱凝胶介质中，红细胞抗原与
相应抗体结合，形成红细胞免疫复合物，在一定离心力下，该复合物不能通过凝胶间隙而
浮于胶表面或悬于胶中：如无相应抗体结合，则不能形成红细胞免疫复合物，在一定离心
力下，分散的红细胞可以通过凝胶间沉于微柱腔底部
【主要组成成分】
本品系在聚丙烯塑料透明卡片上的六支微柱型管中充填凝敗，从左向右顺序支至第三
支和第四支至第六支微管凝胶中均分别充以抗
A
（
24
和
15B
或
A
日和
AB
，鼠单克隆抗
体，或上海血液生物医药与法国
D1GAST
公司混合液）、抗
B
（
133
和
3C
或
BA
，和
BC
，
鼠单克抗体，或上海血液生物医药与法国
DIGAST
公司混合液）、抗
D
（
BS226
，鼠单克隆
抗体）
IgM
试剂。
2
－
25
12
个月。
ABO
及
RhD
血型鉴定试验标准操作规程
一
检验目的
检测红细胞表面
ABO
血型抗原、
RhD
抗原及血清
或血
浆
中抗
A
、抗
B
抗体，确定受检者
ABO
及
RhD
血型。
二
检验原理
手工试管法、玻片法或纸板法
利用标准
IgM
抗
A
／
B
血清鉴定红细胞表面
ABO
抗原即正定型，利用已知
ABO
血型反定型红细胞鉴定同一标本血清
或血浆
中的抗
A
／
B
抗体即反定型，
综合正反定型结果确定受检标本
ABO
血型；
利用标准
IgM
抗
D
直接鉴定
RhD
血型。
微柱凝胶法
ABO
／
RhD
卡的微管中装填有葡聚糖凝
胶颗粒和抗
A
、抗
B
、抗
D
标准血清，如果红细胞表面存在
A
或
B
或
D
抗原，
就会与对应的抗体发生凝集反应，
凝胶颗
粒具有分子筛的作用，可以阻滞凝集的红细胞在离心力的作
用下通过凝胶颗粒，使其悬浮在凝胶颗粒中，未凝集的红细
胞则可以通过凝胶颗粒到达微管底部。
玻璃珠微柱法
ABO
／
RhD
卡的微管中装填有玻璃微
珠和抗
A
、
抗
B
、
抗
D
标准血清，
如果红细胞表面存在
A
或
B
或
D
抗原，就会与对应的抗体发生凝集反应，玻璃微珠具
有分子筛的作用，可以阻滞凝集的红细胞在离心力的作用下
通过玻璃微珠，使其悬浮在玻璃微珠的上端，未凝集的红
细胞则可以通过玻璃微珠之间的微小空隙到达微管底部。
本发明涉及abo/rh(d/c/e)血型检测卡及其制备方法，具体是指采用微柱凝胶技术检测人血红细胞表面的血型抗原，涉及检测卡的组成、制备及其应用。
背景技术：
人红细胞膜上具有特异性抗原类型，而与临床关系更密切的是红细胞abo血型系统及rh血型系统。abo血型不相容输血，几乎毫无例外的会发生溶血性输血反应症状，而rh血型不相容也常常引起新生儿溶血性疾病。因此，正确鉴定abo血型和rh血型是有效输血的重要保障。
目前，主要采用微柱凝胶试验进行血型检测，即红细胞抗原与相应的抗体在凝胶所形成的介质中反应，如红细胞抗原与相应的标准抗体结合，在经过离心后不能通过凝胶为主的分子筛的，则凝胶底部不能检测到红细胞，从而鉴定abo和rh血型。但是目前采用微柱凝胶法制备的血型检测卡普遍存在误判率高、试剂灵敏度差、试剂质量不稳定、抗原抗体亲和性差、实验结果判读误差大、缺少rh(c/e)血型检测等问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种高灵敏度、高特异性、标准化程度高、自动化程度高、判读准确便捷、质量稳定、试验重复性好，能同时进行正反定型和rh(d/c/e)血型定型检测，的一种abo/rh(d/c/e)血型检测卡及其制备方法。
为实现上述目的，本发明以以下设计方案进行：
abo/rh(d/c/e)血型检测卡上具有8个并排的微柱凝胶管，分别为：一个凝胶管中含有抗a特异性凝胶溶液和亮蓝着色剂溶液，一个凝胶管中含有抗b特异性凝胶溶液和柠檬黄着色剂溶液，一个凝胶管中含有抗d特异性凝胶溶液和淡黑着色剂溶液，一个凝胶管中含有抗c特异性凝胶溶液，一个凝胶管中含有抗e特异性凝胶溶液，其余3个凝胶管中含有中性凝胶溶液，用途分别为一个管作为质控孔用于阴性对照，两个管用于abo反定型检测，其中，抗a特异性凝胶溶液由中性凝胶溶液和igm性质的抗a单克隆抗体组成，抗b特异性凝胶溶液由中性凝胶溶液和igm性质的抗b单克隆抗体组成，抗d特异性凝胶溶液由中性凝胶溶液和igm性质的rhd血型的抗d单克隆抗体组成，抗c特异性凝胶溶液由中性凝胶溶液和igm性质的rhc血型的抗c单克隆抗体组成，抗e特异性凝胶溶液由中性凝胶溶液和igm性质的rhe血型的抗e单克隆抗体组成。
制备方法及工艺过程：
一、基础液的配制：基础液的配方如下：
将上述溶液用800毫升纯化水溶解后，使用hcl调节ph至7.0～7.2后，定容至1l。(其中，tris全称为三羟基氨基甲烷)
二、凝胶的选择：
本技术方案选用了可筛选出蛋白分子量为1500～30000的交联葡聚糖凝胶，该凝胶特异性较强，耐酸碱，可适ph范围为2～13、球形完整，均一性好，惰性材料，而且可以节省洗涤去碎片等洗涤过程。
三、抗体的制备：
选择igm性质的抗a单克隆抗体，将选取的抗a单克隆抗体纯化后，使用在基础液中加0.5～1％的牛血清白蛋白及0.5％的海藻糖作为保护液进行稀释抗体，抗体效价不低于1:512、
选择igm性质的抗b单克隆抗体，将选取的抗b单克隆抗体纯化后，使用在基础液中加0.5～1％的牛血清白蛋白及0.5％的海藻糖作为保护液进行稀释抗体，抗体效价不低于1:512、
选择igm性质的抗d单克隆抗体，将选取的抗d单克隆抗体纯化后，使用在基础液中加0.5～1％的牛血清白蛋白及0.5％～2.5％的明胶作为保护液进行稀释抗体，抗体效价不低于1:512、
选择igm性质的抗c单克隆抗体，将选取的抗c单克隆抗体纯化后，使用在基础液中加0.5～1％的牛血清白蛋白及0.5％～2.5％的明胶作为保护液进行稀释抗体，抗体效价不低于1:512、
选择igm性质的抗e单克隆抗体，将选取的抗e单克隆抗体纯化后，使用在基础液中加0.5～1％的牛血清白蛋白及0.5％～2.5％的明胶作为保护液进行稀释抗体，抗体效价不低于1:512、
本部分根据明胶和海藻糖的保护作用的差异性，为不同的抗体选择明胶或海藻糖作为其更适合的保护剂。
四、中性凝胶溶液的制备：将步骤二中所述的交联葡聚糖凝胶与含有1％～3％peg的基础液以1g：(15～19)ml的比例浸泡至少2天后搅匀15～60分钟，让缓冲液与凝胶充分反应，然后再浸泡至少1天。
五、着色剂溶液的制备：
为了便于使用者更好的区分不同微柱，根据美国aabb输血技术相关要求，共选取了三种着色剂，分别为亮蓝着色剂、柠檬黄着色剂、淡黑着色剂。
称取0.6g亮蓝着色剂用10ml纯化水溶解稀释，制备成浓度为0.06g/ml的亮蓝着色剂溶液。
称取0.3g柠檬黄着色剂用10ml纯化水溶解稀释，制备成浓度为0.03g/ml的柠檬黄着色剂溶液。
称取0.5g淡黑着色剂用10ml纯化水溶解稀释，制备成浓度为0.05g/ml的淡黑着色剂溶液。
六、特异性凝胶溶液的制备：
在步骤四所述的中性凝胶溶液中添加步骤三所述的各项抗体，添加浓度为1:5～1:80、分别配置成抗a特异性凝胶溶液、抗b特异性凝胶溶液、抗d特异性凝胶溶液、抗c特异性凝胶溶液、抗e特异性凝胶溶液。
在抗a特异性凝胶溶液中添加亮蓝着色剂溶液，添加比例为1:2000、
在抗b特异性凝胶溶液中添加柠檬黄着色剂溶液，添加比例为1:2000、
在抗d特异性凝胶溶液中添加淡黑着色剂溶液，添加比例为1:2000、
七、八孔卡的准备：
将具有8个并排微柱的八孔卡，在121℃高温下灭菌20分钟，干燥后备用。
八、分装：
将特异性凝胶溶液和中性凝胶溶液进行分装，第1柱为抗a柱，含有抗a特异性凝胶溶液，第2柱为抗b柱，含有抗b特异性凝胶溶液，第3柱为抗d柱，含有抗d特异性凝胶溶液，第4柱为抗c柱，含有抗c特异性凝胶溶液，抗5柱为抗e柱，含有抗e特异性凝胶溶液，第6为中性凝胶溶液作为质控孔，第7及第8孔为中性凝胶溶液作为abo反定型检测用。
九、封口：
本检测卡采用了热封封口，所用的铝箔复合封口膜中的复合材料与八孔卡所用材料一致，这样两者熔点一致，热封时，密封性更好，又较容易控制所用温度。使检测卡使用寿命更长，有效避免干胶及液体的挥发，其中，八孔所用材料为pp、pet、pe、pvc中的一种。
十、产品技术参数：
1、特异性：含相应抗体的特异性凝胶管中，与具有相应抗原的红细胞产生凝集反应，及凝集的红细胞集中出现在凝胶上表面，与不含有相应抗原的红细胞产生非凝集的阴性反应，红细胞可全部通过凝胶沉积在微柱底部，中性凝胶溶液中直接加入红细胞试剂，则红细胞可全部通过凝胶沉积在微柱底部，呈阴性反应。
2、灵敏度：抗a柱与a1型试剂红细胞发生凝集反应时，反应强度不小于4+；与a2型、a2b型试剂红细胞发生凝集反应时，反应强度不小于3+；抗b柱与b型试剂红细胞发生凝集反应时，反应强度应不小于4+；与a2b型试剂红细胞发生凝集反应时，反应强度应不小于3+；抗d柱与正常rhd阳性试剂红细胞发生凝集反应时，反应强度不小于4+；抗c柱与正常rhc阳性试剂红细胞发生凝集反应时，反应强度不小于4+；抗e柱与正常rhe阳性试剂红细胞发生凝集反应时，反应强度不小于4+；ac柱使用抗a抗体检测abo血型反定型红细胞试剂a1红细胞，效价不低于同步检测的反定型试管法试验；bc柱使用抗b抗体检测ab0血型反定型红细胞试剂b红细胞，效价不低于同步检测的反定型试管法试验。
3、重复性：抗原检测柱：用同批检测卡分别对同一样本连续检测10次，结果一致，且阳性结果凝集强度差异不超过1个+，阴性结果不应有凝集、溶血等不易分辨现象；反定型柱：同一批检测卡用凝集强度1+的抗a和抗b抗体分别对a1型红细胞和b红细胞重复实验10次，要求阳性结果的凝集强度均为1+，阴性结果不应有凝集、溶血等不易分辨现象。
十一：产品的使用方法：
1、abo/rh(d/c/e)血型检测卡上具有8个并排的微柱凝胶管，第1到第8柱分别为抗a柱、抗b柱、抗d柱、抗c柱、抗e柱、用于阴性对照检测的质控孔及用于abo反定型检测的ac、bc柱，每张血型检测卡可用于1份样本的检测。
2、用生理盐水将待检样本的红细胞稀释成0.7％～0.9％红细胞悬液，分别加入第1至第6柱中，每柱50ul。
3、取反定型红细胞试剂a1红细胞和b红细胞，用生理盐水将红细胞稀释成0.7％～0.9％红细胞悬液，分别加入第7和第8柱中，每柱50ul。
4、取待检样本的血浆分别加入第7和第8柱中，每柱50ul。
5、将加入样本的检测卡放于离心机中，800rpm、离心2min，1800rpm、离心3min。
6、判读并记录结果。
7、结果判读：红细胞条带位于微柱底部，微柱其余部分不可见凝集物为阴性结果，红细胞在凝胶表面或分散在凝胶中为阳性结果，图1为反应强度示意图。
表1：abo/rhd血型定型检测试剂卡结果判读标准表
表2：abo/rh(d/c/e)血型定型检测试剂卡血型判定结果
十二：本发明具有以下优点：
1、针对不同抗体自身特点，有针对性的添加不同保护剂，以便抗体所处环境为更佳环境，抗体活性保存时间更长，更不易收其他环境的影响。
2、对含有不同抗体的特异性凝胶溶液中，添加不同的着色剂有助于生产及使用中的识别，更利于生产和使用的有效性，避免交叉污染。
3、本发明选用的缓冲液对抗体的稳定性及保护性更有针对性，可以时抗体活性保持更长久，使用了tris缓冲液系统，该缓冲系统的ph值可以稳定的维持在7.0～7.2之间，与抗体保存更适ph7.0～7.3相符，有助于抗体活性的长期保存，使抗体活性保存可超过两年，又可以兼顾红细胞反应所需要的更适ph范围6.9～7.4、又有利于交联葡聚糖凝胶的溶胀。
4、本缓冲系统采用不同浓度的peg作为润滑剂及稳定剂，从而有利于针对不同抗体的特异性对抗体进行更好的保护作用，并加强特异性反应，从而提高抗体的灵敏度。
5、本缓冲液采用了低离子系统，用氯化钠和edta-2na作为维持溶液渗透压的离子，能保证一个长期的低离子环境，从而减少抗原抗体相合的电子阻力，助于加强抗原抗体反应，缩短反应时间，增加亲和性。
6、本缓冲液还增加了一定量的蔗糖，蔗糖有助于增强交联葡聚糖凝胶的润滑性，使交联葡聚糖凝胶的间隙更顺滑，并能增重游离红细胞，更容易使游离红细胞和凝集红细胞分离，加快游离红细胞的沉降。
7、本缓冲液中添加了牛血清白蛋白，牛血清蛋白为抗体稳定剂，起到调节ph值、减低吸附、改善表面张力等作用。牛血清白蛋白作为抗体的稳定保护剂，可以减少抗体的非特异性吸附，增强特异性反应，并且对热不敏感，有利于抗体在非常温下保持活性。
8、本缓冲液采用的叠氮化钠作为防腐剂，能有效的抑制细菌的繁殖生长，优于其他防腐剂对ph值的适用性，该防腐剂所适ph更为广泛，且成本较低，有效的节省成本。
9、本试剂选用的交联葡聚糖凝胶，其间隙只允许游离红细胞通过，弱凝集红细胞也不能完全通过到达柱底，从而能有效的检测弱凝集反应，避免漏检现象。
10、为了在生产分装以及使用时错误使用了检测卡，本检测添加了不同的着色剂，更易分辨和区分检测结果和加样顺序。
附图说明
图1为反应强度示意图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，主要在于帮助阅读者更好的理解本发明，不作为对本发明的限制。
实施例1
一、基础液的配制：基础液的配方如下：
将上述溶液用800毫升纯化水溶解后，使用hcl调节ph至7.0～7.2后，定容至1l。
二、凝胶的选择：
本技术方案选用了可筛选出蛋白分子量为1500～30000的交联葡聚糖凝胶，该凝胶特异性较强，耐酸碱，可适ph范围为2～13、球形完整，均一性好，惰性材料，而且可以节省洗涤去碎片等洗涤过程。
三、抗体的制备：
选择igm性质的抗a单克隆抗体，将选取的抗a单克隆抗体纯化后，使用在基础液中加0.7％的牛血清白蛋白及0.5％的海藻糖作为保护液进行稀释抗体，抗体效价不低于1:512、
选择igm性质的抗b单克隆抗体，将选取的抗b单克隆抗体纯化后，使用在基础液中加0.7％的牛血清白蛋白及0.5％的海藻糖作为保护液进行稀释抗体，抗体效价不低于1:512、
选择igm性质的抗d单克隆抗体，将选取的抗d单克隆抗体纯化后，使用在基础液中加0.7％的牛血清白蛋白及2.5％的明胶作为保护液进行稀释抗体，抗体效价不低于1:512、
选择igm性质的抗c单克隆抗体，将选取的抗c单克隆抗体纯化后，使用在基础液中加0.7％的牛血清白蛋白及0.5％的明胶作为保护液进行稀释抗体，抗体效价不低于1:512、
选择igm性质的抗e单克隆抗体，将选取的抗e单克隆抗体纯化后，使用在基础液中加0.7％的牛血清白蛋白及0.5％的明胶作为保护液进行稀释抗体，抗体效价不低于1:512、
本部分根据明胶和海藻糖的保护作用的差异性，为不同的抗体选择明胶或海藻糖作为其更适合的保护剂。
四、中性凝胶溶液的制备：
1、抗a柱中性凝胶溶液的制备：将步骤二中所述的交联葡聚糖凝胶与含有1％peg的基础液以1g：(15～19)ml的比例浸泡2天后，均匀搅拌15分钟，让缓冲液与凝胶充分反应，然后再浸泡至少1天。
2、抗b柱中性凝胶溶液的制备：将步骤二中所述的交联葡聚糖凝胶与含有1％peg的基础液以1g：(15～19)ml的比例浸泡2天后，均匀搅拌15分钟，让缓冲液与凝胶充分反应，然后再浸泡至少1天。
3、抗d柱中性凝胶溶液的制备：将步骤二中所述的交联葡聚糖凝胶与含有1.5％peg的基础液以1g：(15～19)ml的比例浸泡2天后，均匀搅拌15分钟，让缓冲液与凝胶充分反应，然后再浸泡至少1天。
4、抗c柱中性凝胶溶液的制备：将步骤二中所述的交联葡聚糖凝胶与含有1.5％peg的基础液以1g：(15～19)ml的比例浸泡2天后，均匀搅拌15分钟，让缓冲液与凝胶充分反应，然后再浸泡至少1天。
5、抗e柱中性凝胶溶液的制备：将步骤二中所述的交联葡聚糖凝胶用含有1.5％peg的基础液以1g：(15～19)ml的比例浸泡2天后，均匀搅拌15分钟，让缓冲液与凝胶充分反应，然后再浸泡至少1天。
6、ac柱中性凝胶溶液的制备：将步骤二中所述的交联葡聚糖凝胶用含有1％peg的基础液以1g：(15～19)ml的比例浸泡2天后，均匀搅拌15分钟，让缓冲液与凝胶充分反应，然后再浸泡至少1天。
7、bc柱中性凝胶溶液的制备：将步骤二中所述的交联葡聚糖凝胶用含有1％peg的基础液以1g：(15～19)ml的比例浸泡2天后，均匀搅拌15分钟，让缓冲液与凝胶充分反应，然后再浸泡至少1天。及用于abo反定型检测的ac、bc柱中性凝胶溶液
8、质控孔中性凝胶溶液的制备：将步骤二中所述的交联葡聚糖凝胶用含有3％peg的基础液以1g：(15～19)ml的比例浸泡2天后，均匀搅拌15分钟，让缓冲液与凝胶充分反应，然后再浸泡至少1天。
五、着色剂溶液的制备：
为了便于使用者更好的区分不同微柱，根据美国aabb输血技术相关要求，共选取了三种着色剂，分别为亮蓝着色剂、柠檬黄着色剂、淡黑着色剂。
称取0.6g亮蓝着色剂用10ml纯化水溶解稀释，制备成浓度为0.06g/ml的亮蓝着色剂溶液。
称取0.3g柠檬黄着色剂用10ml纯化水溶解稀释，制备成浓度为0.03g/ml的柠檬黄着色剂溶液。
称取0.5g淡黑着色剂用10ml纯化水溶解稀释，制备成浓度为0.05g/ml的淡黑着色剂溶液。
六、特异性凝胶溶液的制备：
在步骤四所述的中性凝胶溶液中添加步骤三所述的各项抗体，添加浓度为1:45、分别配置成抗a特异性凝胶溶液、抗b特异性凝胶溶液、抗d特异性凝胶溶液、抗c特异性凝胶溶液、抗e特异性凝胶溶液。
在抗a特异性凝胶溶液中添加亮蓝着色剂溶液，添加比例为1:2000、
在抗b特异性凝胶溶液中添加柠檬黄着色剂溶液，添加比例为1:2000、
在抗d特异性凝胶溶液中添加淡黑着色剂溶液，添加比例为1:2000、
七、八孔卡的准备：
将具有8个并排微柱的八孔卡，在121℃高温下灭菌20分钟，干燥后备用。
八、分装：
将特异性凝胶溶液和中性凝胶溶液进行分装，第1柱为抗a柱，含有抗a特异性凝胶溶液，第2柱为抗b柱，含有抗b特异性凝胶溶液，第3柱为抗d柱，含有抗d特异性凝胶溶液，第4柱为抗c柱，含有抗c特异性凝胶溶液，抗5柱为抗e柱，含有抗e特异性凝胶溶液，第6为中性凝胶溶液作为质控孔，第7及第8孔为中性凝胶溶液作为abo反定型检测用。
九、封口：
本检测卡采用了热封封口，所用的铝箔复合封口膜中的复合材料与八孔卡所用材料一致，这样两者熔点一致，热封时，密封性更好，又较容易控制所用温度。使检测卡使用寿命更长，有效避免干胶及液体的挥发，其中，八孔所用材料为pp。
十、产品技术参数：
1、特异性：含相应抗体的特异性凝胶管中，与具有相应抗原的红细胞产生凝集反应，及凝集的红细胞集中出现在凝胶上表面，与不含有相应抗原的红细胞产生非凝集的阴性反应，红细胞可全部通过凝胶沉积在微柱底部，中性凝胶溶液中直接加入红细胞试剂，则红细胞可全部通过凝胶沉积在微柱底部，呈阴性反应。
2、灵敏度：抗a柱与a1型试剂红细胞发生凝集反应时，反应强度不小于4+；与a2型、a2b型试剂红细胞发生凝集反应时，反应强度不小于3+；抗b柱与b型试剂红细胞发生凝集反应时，反应强度应不小于4+；与a2b型试剂红细胞发生凝集反应时，反应强度应不小于3+；抗d柱与正常rhd阳性试剂红细胞发生凝集反应时，反应强度不小于4+；抗c柱与正常rhc阳性试剂红细胞发生凝集反应时，反应强度不小于4+；抗e柱与正常rhe阳性试剂红细胞发生凝集反应时，反应强度不小于4+；ac柱使用抗a抗体检测abo血型反定型红细胞试剂a1红细胞，效价不低于同步检测的反定型试管法试验；bc柱使用抗b抗体检测ab0血型反定型红细胞试剂b红细胞，效价不低于同步检测的反定型试管法试验。
3、重复性：抗原检测柱：用同批检测卡分别对同一样本连续检测10次，结果一致，且阳性结果凝集强度差异不超过1个+，阴性结果不应有凝集、溶血等不易分辨现象；反定型柱：同一批检测卡用凝集强度1+的抗a和抗b抗体分别对a1型红细胞和b红细胞重复实验10次，要求阳性结果的凝集强度均为1+，阴性结果不应有凝集、溶血等不易分辨现象。
表1：abo/rhd血型定型检测试剂卡结果判读标准表
表2：abo/rh(d/c/e)血型定型检测试剂卡血型判定结果
实施例2
一、基础液的配制：基础液的配方如下：
将上述溶液用800毫升纯化水溶解后，使用hcl调节ph至7.0～7.2后，定容至1l。
二、凝胶的选择：
本技术方案选用了可筛选出蛋白分子量为1500～30000的交联葡聚糖凝胶，该凝胶特异性较强，耐酸碱，可适ph范围为2～13、球形完整，均一性好，惰性材料，而且可以节省洗涤去碎片等洗涤过程。
三、抗体的制备：
选择igm性质的抗a单克隆抗体，将选取的抗a单克隆抗体纯化后，使用在基础液中加0.7％的牛血清白蛋白及0.5％的海藻糖作为保护液进行稀释抗体，抗体效价不低于1:512、
选择igm性质的抗b单克隆抗体，将选取的抗b单克隆抗体纯化后，使用在基础液中加0.7％的牛血清白蛋白及0.5％的海藻糖作为保护液进行稀释抗体，抗体效价不低于1:512、
选择igm性质的抗d单克隆抗体，将选取的抗d单克隆抗体纯化后，使用在基础液中加0.7％的牛血清白蛋白及2.5％的明胶作为保护液进行稀释抗体，抗体效价不低于1:512、
选择igm性质的抗c单克隆抗体，将选取的抗c单克隆抗体纯化后，使用在基础液中加0.7％的牛血清白蛋白及0.5％的明胶作为保护液进行稀释抗体，抗体效价不低于1:512、
选择igm性质的抗e单克隆抗体，将选取的抗e单克隆抗体纯化后，使用在基础液中加0.7％的牛血清白蛋白及0.5％的明胶作为保护液进行稀释抗体，抗体效价不低于1:512、
本部分根据明胶和海藻糖的保护作用的差异性，为不同的抗体选择明胶或海藻糖作为其更适合的保护剂。
四、中性凝胶溶液的制备：
1、抗a柱中性凝胶溶液的制备：将步骤二中所述的交联葡聚糖凝胶与含有1.5％peg的基础液以1g：(15～19)ml的比例浸泡3天后，均匀搅拌20分钟，让缓冲液与凝胶充分反应，然后再浸泡至少1天。
2、抗b柱中性凝胶溶液的制备：将步骤二中所述的交联葡聚糖凝胶与含有1.5％peg的基础液以1g：(15～19)ml的比例浸泡3天后，均匀搅拌20分钟，让缓冲液与凝胶充分反应，然后再浸泡至少1天。
3、抗d柱中性凝胶溶液的制备：将步骤二中所述的交联葡聚糖凝胶与含有2％peg的基础液以1g：(15～19)ml的比例浸泡3天后，均匀搅拌20分钟，让缓冲液与凝胶充分反应，然后再浸泡至少1天。
4、抗c柱中性凝胶溶液的制备：将步骤二中所述的交联葡聚糖凝胶与含有2％peg的基础液以1g：(15～19)ml的比例浸泡3天后，均匀搅拌20分钟，让缓冲液与凝胶充分反应，然后再浸泡至少1天。
5、抗e柱中性凝胶溶液的制备：将步骤二中所述的交联葡聚糖凝胶用含有2％peg的基础液以1g：(15～19)ml的比例浸泡3天后，均匀搅拌20分钟，让缓冲液与凝胶充分反应，然后再浸泡至少1天。
6、ac柱中性凝胶溶液的制备：将步骤二中所述的交联葡聚糖凝胶用含有1％peg的基础液以1g：(15～19)ml的比例浸泡3天后，均匀搅拌20分钟，让缓冲液与凝胶充分反应，然后再浸泡至少1天。
7、bc柱中性凝胶溶液的制备：将步骤二中所述的交联葡聚糖凝胶用含有1％peg的基础液以1g：(15～19)ml的比例浸泡3天后，均匀搅拌20分钟，让缓冲液与凝胶充分反应，然后再浸泡至少1天。及用于abo反定型检测的ac、bc柱中性凝胶溶液
8、质控孔中性凝胶溶液的制备：将步骤二中所述的交联葡聚糖凝胶用含有2.8％peg的基础液以1g：(15～19)ml的比例浸泡3天后，均匀搅拌20分钟，让缓冲液与凝胶充分反应，然后再浸泡至少1天。
五、着色剂溶液的制备：
为了便于使用者更好的区分不同微柱，根据美国aabb输血技术相关要求，共选取了三种着色剂，分别为亮蓝着色剂、柠檬黄着色剂、淡黑着色剂。
称取0.6g亮蓝着色剂用10ml纯化水溶解稀释，制备成浓度为0.06g/ml的亮蓝着色剂溶液。
称取0.3g柠檬黄着色剂用10ml纯化水溶解稀释，制备成浓度为0.03g/ml的柠檬黄着色剂溶液。
称取0.5g淡黑着色剂用10ml纯化水溶解稀释，制备成浓度为0.05g/ml的淡黑着色剂溶液。
六、特异性凝胶溶液的制备：
在步骤四所述的中性凝胶溶液中添加步骤三所述的各项抗体，添加浓度为1:80、分别配置成抗a特异性凝胶溶液、抗b特异性凝胶溶液、抗d特异性凝胶溶液、抗c特异性凝胶溶液、抗e特异性凝胶溶液。
在抗a特异性凝胶溶液中添加亮蓝着色剂溶液，添加比例为1:2000、
在抗b特异性凝胶溶液中添加柠檬黄着色剂溶液，添加比例为1:2000、
在抗d特异性凝胶溶液中添加淡黑着色剂溶液，添加比例为1:2000、
七、八孔卡的准备：
将具有8个并排微柱的八孔卡，在121℃高温下灭菌20分钟，干燥后备用。
八、分装：
将特异性凝胶溶液和中性凝胶溶液进行分装，第1柱为抗a柱，含有抗a特异性凝胶溶液，第2柱为抗b柱，含有抗b特异性凝胶溶液，第3柱为抗d柱，含有抗d特异性凝胶溶液，第4柱为抗c柱，含有抗c特异性凝胶溶液，抗5柱为抗e柱，含有抗e特异性凝胶溶液，第6为中性凝胶溶液作为质控孔，第7及第8孔为中性凝胶溶液作为abo反定型检测用。
九、封口：
本检测卡采用了热封封口，所用的铝箔复合封口膜中的复合材料与八孔卡所用材料一致，这样两者熔点一致，热封时，密封性更好，又较容易控制所用温度。使检测卡使用寿命更长，有效避免干胶及液体的挥发，其中，八孔所用材料为pet。
十、产品技术参数：
1、特异性：含相应抗体的特异性凝胶管中，与具有相应抗原的红细胞产生凝集反应，及凝集的红细胞集中出现在凝胶上表面，与不含有相应抗原的红细胞产生非凝集的阴性反应，红细胞可全部通过凝胶沉积在微柱底部，中性凝胶溶液中直接加入红细胞试剂，则红细胞可全部通过凝胶沉积在微柱底部，呈阴性反应。
2、灵敏度：抗a柱与a1型试剂红细胞发生凝集反应时，反应强度不小于4+；与a2型、a2b型试剂红细胞发生凝集反应时，反应强度不小于3+；抗b柱与b型试剂红细胞发生凝集反应时，反应强度应不小于4+；与a2b型试剂红细胞发生凝集反应时，反应强度应不小于3+；抗d柱与正常rhd阳性试剂红细胞发生凝集反应时，反应强度不小于4+；抗c柱与正常rhc阳性试剂红细胞发生凝集反应时，反应强度不小于4+；抗e柱与正常rhe阳性试剂红细胞发生凝集反应时，反应强度不小于4+；ac柱使用抗a抗体检测abo血型反定型红细胞试剂a1红细胞，效价不低于同步检测的反定型试管法试验；bc柱使用抗b抗体检测ab0血型反定型红细胞试剂b红细胞，效价不低于同步检测的反定型试管法试验。
3、重复性：抗原检测柱：用同批检测卡分别对同一样本连续检测10次，结果一致，且阳性结果凝集强度差异不超过1个+，阴性结果不应有凝集、溶血等不易分辨现象；反定型柱：同一批检测卡用凝集强度1+的抗a和抗b抗体分别对a1型红细胞和b红细胞重复实验10次，要求阳性结果的凝集强度均为1+，阴性结果不应有凝集、溶血等不易分辨现象。
表1：abo/rhd血型定型检测试剂卡结果判读标准表
表2：abo/rh(d/c/e)血型定型检测试剂卡血型判定结果
上述实施例和说明书中描述的只是发明的主要特征及优点，对于本行业的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思和范围的前提下，还可以做出各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。
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2024-03-25
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