1、DNA提取和常见问题分析及对策主讲人：关锰DNA简单介绍DNA是遗传信息的载体，是更重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。 为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高 分子量和高纯度的DNA是非常重要的前提。DNA提取原则。保证DNA结构的完整性。纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质。排除有机溶剂和金属离子的污染。蛋白质、多糖、酚类等降低到更低程度。排除其他核酸分子的污染DNA提取的几种方法一、染色体DNA的提取CTAB法SDS法 其它DNA提取的几种方法二、非染色体DNA的提取质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法CTAB法原理（植物DNA
2、提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基 三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜， 并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通 过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙 醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15、CTAB法流程图植物材料裂解液异丙醇沉淀液氮研磨抽提离心洗涤DNA溶液细胞裂解上溶液干燥溶解CTAB中各个组分的作用CTAB提取缓冲液的经典配方。Tr
3、is-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；。EDTA螯合Mg2+离子或Mn2+离子，抑制DNase活性；。NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；。CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；。-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。CTAB提取缓冲液的改进配方PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少 DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效 去除多糖。除蛋白质：? 氯仿/异戊醇抽提(氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离；异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡）。
4、? 使用变性剂变性 (SDS。异硫氰酸胍等）? 高盐洗涤? 蛋白酶处理除多糖：> 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。> 用多糖水解酶将多糖降解。> 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。除酚类物质：> 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇。抗坏血酸。半胱氨酸。二硫苏糖醇等> 加入易与酚类结合的试剂：如PVP。PEG(聚乙二 醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类 与DNA的结合除盐离子：70的乙醇洗涤TE中成分的作用> TE中的EDTA能螯和Mg2+或
5、Mn2+离子，抑制DNase> pH值为8.0、可防止DNA发生酸解称取样品，液氮研磨，加入预热的(65 ) CTAB及-巯基乙醇保温1h,期间不停的摇均吸取上清液,移至新的离心管中,加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻缓颠倒 混匀,10000rpm,10min取上清液，移至新的离心管中,加等体积氯仿：异戊醇,颠倒混匀,10000rpm,10min取上清液，加入0.6-0.7V的异丙醇（预冷），后4 /-20 保温沉淀10000rpm,10min离心取沉淀，70%乙醇清洗两次，吹干用TE溶解DNA,然后低温保存应注意的问题材料准备：更好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融。液氮
6、研磨： 研磨样品时要有液氮的保护，在整个过程中都不要让液氮 挥发干净。避免材料回温和反复冻融带来的降解。此外尽 量将样品研磨的很细，这样可以提高DNA产量。细胞裂解： 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低。 高温温浴时，定时轻柔振荡。应注意的问题DNA沉淀：用乙醇或异丙醇都可以。异丙醇沉淀的效率要高于无水乙醇，试验中只需要0.6倍体积的异丙醇沉淀；而需要2倍体 积的无水乙醇。但是异丙醇沉淀容易将盐成分一起沉淀， 且在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去 。DNA干燥：晾干DNA，让乙醇充分挥发。DNA溶解：若长期储存建议使用TE缓冲液溶解。基因组DNA的检测> 高质量的基因组DN
7、A带型 单一无拖尾现象> DNA浓度及纯度的检测 A260=1约 50 g/ mL> 双链 DNA， A260/280约为1.8DNA提取常见问题问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。原因1、 DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2、 DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制对后续酶解反应策3、 DNA中残留有金属离子4、 有RNA的存留重新纯化DNA，过吸附 柱去除蛋白、多糖、 多酚等杂质重新沉淀DNA，让酒精 充分挥发增加70乙醇洗涤的 次数（2-3次）加入RNase降解RNADNA提取常见问题问题二：DNA降解。原因1、 材料不新鲜或反复冻 融2、 未很好抑制内源核酸酶的活性对策3、 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断4、 外源核酸酶污染5、 反复冻融1、 尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融2、 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液3、 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量，细胞裂解后的后续操作应 尽量轻柔4、 所有试剂用无菌水配制，耗材经高 温灭菌5、 将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融DNA
2
结果
2
成功的建立
HSV
-
致死性感染动
物模型
HSV
感染
滴
度为
10
6
ID
50
/
0
1ml
死亡小
鼠各组织器官涂片上
HSV
抗原
均呈阳性反应
表明小鼠死于
HSV
感染
2
2
空
白
对
照
组
小
鼠
100
%
健
康
存
活
致
死
攻
击
组
小
鼠
100
%
发病死亡
多于
感染
后第
4
～
天
出现
茸毛
、
抽
搐
、
下
肢麻痹等脑炎症状
～
7
d
内死亡
M
cAbS
被动免疫实验组
对小鼠均有保护作用
3
、
4
组小鼠全部存活
21
d
以上
组于感染后第
15
天发生
只鼠死亡
其余全部存活
于
感
染后
24
d
将第
3
4
组小
鼠人工
处死
以上表
明
HSV
-
M
cAbS
对
HSV
-
致死性感
染的小
鼠几乎
100
%
有特
异性
保
护治疗作用
另外
致
死攻
击组
小
鼠各
组织
器
官涂
片
HSV
抗原均呈强阳性
其余各组与对照
组为阴性
表
明小鼠感
染
HSV
后
发生病毒血症导致死亡
3
讨论
HSV
属于疱疹病毒科的具有代表性的典型疱疹病毒
其
核酸为线
状
双
股
DNA
有
两
种
血
清
型
HSV
-
和
HSV
-
2
两型病毒的
DNA
有
50
%
的同源性
因此有型间共同抗原
也
有型特异性抗原
HSV
病毒
体有
6
种
与细胞
膜相关
的糖
蛋
白
分别为糖蛋白
B
g
B
、
gC
、
gD
、
g
E
、
gG
和
g
H
其
中
gB
、
g
D
与病毒感染的吸附及穿
入有
关
gH
与
病毒释
放有
关
[
7
]
g
D
是
HSV
-
和
HSV
-
2
的共同抗原决定簇
其抗
gD
抗体属中和
抗体
中和病毒的能力更强
能与
HSV
的
g
D
抗原特
异结合
结果改变了
病
毒的
表
面结
构
阻
断了
病毒
对
宿主
细胞
的
吸
附
使病毒失去
了感
染能
力
[
8
]
本
实验
所用
的
M
cAbS
中
既
有能识别
HSV
的
gB
、
g
D
抗原
的
型共
同性
特
异性
单克
隆
抗
体
也有能识别
HSV
的
g
C
的型
特异
性单
克隆抗
体
体外
中
和试验也证明其中和效价为
10
～
10
7
具有很强
的中和病
毒
的作用
[
9
]
本实验结果在观察期内
空白对照组
100
%
存活
且
HSV
抗
原呈
阴性
致
死对
照组
100
%
死亡
HSV
抗原
呈
强阳性
证实
本组
小鼠
死于
HSV
感
染
采用
M
cA
b
进行
被
动免疫治疗的
3
组
与致死对照
组相比均取
得明显疗效
但
采用被动免疫
治疗的
3
组
之间没
有显
著差
异
在观察
期内
HSV
-
攻击前
24
h
注射
M
cAb
15
天死
亡
只
其余全
部
存活
而且
HSV
抗原呈阴性
反应
在体内
HSV
-
McAb
对病毒致死性攻击
具有特
异性
被动
保护作
用
对机
体内
各
免疫指标不会产生明显影响
这种保护作用与
HSV
-
McAb
在体外的中和活性呈现较好的正相关关
系
即
体内保护作
用
强
体外中和效价也高
[
10
]
推测体外没
有中和活
性的
M
cA
b
体内也不会有保护作用
通过建立
HSV
致死性
感染动物
模
型
以及
M
cAbS
被动免疫试
验
探
讨了
株
M
cA
b
的保护
作
用
证明了
HSV
糖蛋白在单纯疱疹病毒
感染中
型共同性
和
型特异性抗原决定
簇在体
内的
表达
本
研究
结果为
疱疹
性
疾病的治疗提供了科学的理论基础和实验依据
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1995
24
4
335
-
337
DNA
测序中的一些常见问题和对策
贺光
邱广蓉
孙开来
国内基础医学院医学遗传学教研
辽宁
沈阳
110001
【
】
DN
A
测序在现代分子
生物学实验技术中
占有重
要地位
是进
行其他
研究的
基础和
前提
DNA
测序
方
法有
酶促双脱氧法和化学法
在
DNA
测序中存在一些问
题
可
能降低
测序的
效能
影响结
果的准
确性及
重复性
本文就测序中常见问题和解决方法作简要论述
【
关键词
】
DNA
测序
酶促双脱氧法
化学法
【
中图分类
】
Q
33
【
文献标识码
】
A
【
文章编
】
0258
-
4646
2002
05
-
0366
-
01
DNA
测序是一种多步骤的复杂
过程
是重组
DNA
技
术
的前提
测序
结果
结合
计
算机
分
析是
获得
限
制性
酶谱
更
常
用
、
更快捷的方法
对于获得的未知片段
A260/280比值较低？或者A260/280比值较高？
参考见解：用水作为洗脱液比较偏低，或者蛋白质残留，但如果操作过程中使用了苯酚，则更可能是苯酚残留。而比较高可能是大量RNA残留，没有使用RNaseA，或RNaseA活性下降。A260 值提示的含量与电泳检测时提示的含量有可见的误差则为苯酚残留。
DNA影响后续酶反应试验？
参考见解：
1、 在洗脱液中有残留的漂洗液GW，可通过再次的离心去除硅胶膜上的GW。
2、 大量RNA残留。
在缓冲液GA GB 中有白色沉淀？
参考见解：白色沉淀可能使由于低温或长时间放置产生，可在使用前在56℃重新加热融解。
在操作中加入缓冲液GB有白色沉淀？
参考见解：在缓冲液GB加入后产生的白色沉淀在70℃温浴时会消失，不会影响下游的操作。
CTAB法提取DNA,CTAB为什么要预热？
参考见解：
1、 CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15℃。
2、 促进CTAB更好的溶解，以提高其释放植物组织中DNA的效率，先达到了反应温度，这样实际作用时间要比不预热短一些。
在用CTAB法提取玉米嫩叶DNA，所取到的DNA为什么是黄色或黑色而不是呈白色？
参考见解：
1、 可能是色素的问题，不同的材料会出现不同的颜色，用这些应当可以P出来东西。
2、 你取样的时候带上了别的东西 ，或者洗涤的时候没有洗干净。
CTAB法抽提DNA，95％的乙醇沉淀后，用1/10体积3mol/L的NaAc（pH5.2）和1体积的76％的乙醇洗涤后，自然晾干后加65度的TE（pH8.0），TE的量并不少，可总是溶的不好，什么原因？
参考见解：不能溶解不要紧，离心机大力离心后取上清，加入无水乙醇沉淀后在用TE重悬，提取的DNA要纯些。也可以吸取溶解了的TE液加入异丙醇再次沉淀。
用CTAB法抽提的，CTAB和DTT（二硫苏糖醇）混合后加入磨碎的叶子中，65度30分，后用氯仿/异戊醇去蛋白，吸上清加异丙醇，但没有看见DNA，叶子的量很多，取的是四叶期更老的叶子。为什么？
参考见解：老叶子破壁困难，DNA难以释放出来。
1、 尽量磨细叶片，更好用液氮反复几次研磨为粉末状；
2、 延长CTAB的作用时间，期间不时摇匀。
也可能由于叶子量太大，而CTAB量少，导致得到的液体粘稠，无法混匀，细胞破裂不完全，DNA少；可试着用大的离心管，多加入CTAB，65度温浴并不时地摇匀。
抽提过程中的现象及可能的原因？
参考见解：
1、 核酸不溶解或者难溶解 – 蛋白质残留 (虽然目前更多的资料强调的是过分干燥所致。)。75% 乙醇洗涤后，如果是空气干燥，几乎不可能过分干燥的，尤其是在南方潮湿的地方。佐证实验：撕取少量 Merck 的丝状CT DNA 到一个离心管中，加入无水乙醇；10 分钟后彻底去除乙醇；待乙醇完全挥发后，加入 TE，10 分钟后溶液就非常均匀而粘稠了。
2、 使用异丙醇沉淀核酸，沉淀为白色 – 多糖残留。
3、 核酸溶解后为乳白色 – 多糖残留。
4、 75% 乙醇洗涤异丙醇沉淀的核酸时，沉淀变大了。
降解的现象、原因及对策？
参考见解：降解的现象，如果抛开问题电泳所致，可以简单总结如下：主带不再突出，向小片段方向发生弥散，亮度比较均衡地衰减。如果同时还伴随下列的一个或者多个现象，则需要更进一步的检测：加样孔非常的亮、弥散发生在主条带位置的上下两个方向、从加样孔即开始发生弥散。以现在的裂解液的裂解能力而言，降解的发生主要是在彻底匀浆之前，只有极少量由不干净的溶解液导致。以总 RNA 抽提为例，本站就有帖总结为：总 RNA 的质量由高到低依次为悬浮细胞、贴壁细胞、组织 (此处的质量不仅指纯度，也指完整性才对)。彻底裂解悬浮细胞的时间更短，彻底裂解组织的时间更长，这就是降解多发生在彻底匀浆之前的一个佐证。再看一看新鲜样品和冷冻保存样品，非常严格的冷冻保存和匀浆操作的确可以确保冷冻样品的核酸的质量；但是，有许多实验并不具备严格的保存手段，实验人员的操作也并非完美，其结果就是核酸的降解。
RNA 抽提受的影响因素太多，就以基因组 DNA 的抽提为例看一看吧。假定消化使用的是含蛋白酶 K 的溶液，无论你使用的是新鲜样品还是冷冻保存样品，如果混匀彻底，可以预期的降解为：细胞 – 不应该降解，碾碎的组织 – 不应该降解，大块组织 (包括鼠尾) – 部分降解。如果电泳发现新鲜的细胞和碾碎的新鲜组织发生了降解现象，该现象是假象；如果电泳发现冷冻的细胞和碾碎的冷冻组织发生了降解现象，该现象不是假象，就是样品在保存中已经降解了。说得更极端一点，即使蛋白酶 K 失活了，消化试剂的裂解能力也足以保证细胞的基因组 DNA 在抽提过程中间不被降解。减少或者杜绝核酸降解，一定要将重点放在样品被彻底匀浆之前。样品的保存在前面已经说过了，不重复。其次就是要缩短样品从脱离原来的生存环境或者低温到被彻底匀浆之间的时间。
后续酶反应失败？
参考见解：首先从资料书中着手。如果三次实验后，问题还没有解决，那么 90% 的可能在于洗涤方式的不严格导致的小分子物的残留。小分子物像刀，可以陆续“杀”死很多酶；大分子物如蛋白质，像绳子，只能“捆住”一个目的核酸或者酶。更严格的洗涤可以解决该问题。
蛋白质是如何残留的？
参考见解：
1、 PC 纯化：a-取上清时取到中间及下；b- PC 用量不足；c-混匀不彻底；d-溶解于上清中的少量 PC 中含有的蛋白质。
2、 高盐沉淀：a-取上清时取到了蛋白沉淀；b-裂解不彻底；c-裂解液用量不足，使裂解体系太粘稠；d-溶解度问题 (可以使用低温沉淀加以改善)。介质：a-裂解不彻底；b-裂解体系太粘稠。
小分子物质 (苯酚、盐) 是如何残留的？
参考见解：
1、 醇沉淀：洗涤不彻底。其原因与管子、操作手法等有关。
2、 介质：颗粒状介质的原因与醇沉淀相同。柱式的几乎都是柱子设计上的缺陷所致，极少数由操作者未严格按要求操作所致。
核酸抽提中的温度问题？
参考见解：核酸抽提中的温度问题，也是一个值得关注的问题。首先要明确的一点是，任何一个温度条件，对某些方面有利，同时也一定会有不利的一面。如沉淀，低温操作会提高得率，但也会增加杂质的残留。任何一步操作该用什么温度为好，应该是利弊权衡的结果。基本上，除了一些特殊的步骤，如消化等外，用温是更好的选择。那些认为“低温操作可以防止或者减少降解”之类的理由，并没有多少可操作性的。低温的确可以减低酶的活性，但低温同时也降低了这些酶被裂解液中的试剂灭活或者抑制的速度，此消彼长，没有办法给出结论的。就 RNA 抽提而言，彻底匀浆前在冰上操作可以降低 RNA 被降低的风险，彻底匀浆后的温度对 RNA 的完整性影响已经不会大的；如果发现影响很大，说明 RNase 没有被裂解液有效抑制，提示裂解液的用量不足。更没有道理的是认为低温沉淀和低温洗涤可以防止降解了。事实上，核酸一旦被沉淀下来，对酶的耐受力是很强的，这就是核酸保存在醇溶液中更稳定的理论基础。如果说沉淀使用低温还可以提高得率，洗
以上关于“DNA实验误差的主要原因及解决方法有哪些？”的全部内容了，想要了解更多亲子鉴定相关资讯，请继续关注本站。
2024-03-26
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