在过去的十年间，二代测序方法和平台日趋完善，数据准确度显著提升，在临床领域如疾病筛查、诊断、遗传分析等方面应用广泛。与此同时，领域也开始关注二代测序，通过运用二代测序技术，基于一次实验、一份微量生物检材就可以同时获得STR、SNP、Indel和mRNA等各种类型的遗传标记信息，这是现有一代测序平台所无法做到的大量遗传标记信息的获得，为遗传领域带来了新的突破和契机。
那么上述二代测序技术中的多种遗传标记信息在学中是如何具体应用的呢？
说到遗传标记，当属STR。
什么是STR？STR即短串联重复序列（short tandem repeat），也称微卫星DNA（microsatellite DNA），是以2~6个碱基作为核心单位，重复串联形成的一类DNA序列。整个人类基因组中平均每15kb就存在一个STR，目前已发现超过7000个。由于STR核心单位重复数目在个体间呈现高度差异性且数量丰富，构成了其遗传多态性。
STR有何优势？STR基因座除高度多态性外，还具有突变率低、鉴别能力强、检测易于标准化等优点，目前上通用的打击违法犯罪的DNA数据库也多数基于STR基因座而建立。
STR检测目前实践中STR基因座分型多采用荧光标记的PCR-CE技术，也是STR分型技术的金标准。PCR-CE技术具有高的分辨率，即使核心序列相差一个重复次数也能成功分型；并且检测结果分型图谱直观、易于分析。但是，PCR-CE分析存在一些不可避免的问题：
1、PCR-CE技术分析的仅为基因序列长度的多态性，对于序列内碱基的差异无法分辨；2、对于混合检材分析，不同来源检材含量的比例相差悬殊时，PCR-CE往往检测不到混合物中量少的检材；3、图谱分析中经常会遇到一些影响分型甚至导致错误分型情况，如等位基因分型标准物命名错误、内标识别错误、图谱中基线的跳跃和摆动、stutter峰、off-ladder峰等。
NGS技术的诞生，很好的解决了PCR-CE在STR检测中出现的上述问题：
1、NGS进行STR分析更为精细化，可准确检测DNA序列，展示STR等位基因核心序列和侧翼序列的真实差异。通过NGS测序，可以发现原本经PCR-CE分析是相同基因型的STR基因座，其实是不同的基因型。这也表明若实现同等的分辨能力，NGS所需的基因座数量更少；2、对于混合型检测中的微量检材，NGS以其高通量的特性，通过对大量数据的处理和分析，可以灵敏地检测到微量检材的DNA序列；3、基于一份微量检材的一次实验，NGS在获得STR的同时，还可以获得SNP、Indel、mRNA等各种类型的大量遗传标记信息，而这是现有一代测序平台所无法做到的。从微量的生物检材中挖掘出案件所需要的全部遗传学相关信息，这对于公安实战来说具有无可比拟的吸引力。
案例分析目前，NGS技术在学中的应用已经逐步崭露头角。不久前荷兰阿姆斯特丹的一起性侵案中，专家通过对混合检材进行分析检测，成功获得了嫌疑人的DNA信息，并以此为证据，将罪犯送上法庭。这起性侵犯罪案件与欧洲、美洲乃至世界其它地区的性侵案件类似。更初的案件检材取自受害者的混合样本，Y-STR分析结果表明其可能来源于至少两名男子的22个STR分型。而后通过进一步进行NGS分析，样本的DNA特征与2008年录入荷兰数据库中的一名生于1990年的嫌疑人相匹配，更终该男子罪名成立，被判处3年监禁。虽然在此之前，NGS帮助破获案件的消息也时有报道，但此次是NGS技术次作为证据出现在法庭上，并获得了协商的成功。这表明NGS技术日趋成熟和完善，并已经能够运用到实际案件中。
阅微基因NGS试剂盒应用流程
NGS技术为检测提供了更大的扩展能力、更高的分辨率、更快的检测效率和更可靠的结果。阅微基因自主研发的NGS试剂盒，作为疑难检材的有效辅助手段，能够同时检测29个STR基因座和52个SNP位点，对于微量及降解的DNA有良好的检出率，该试剂盒投入场不久就协助成功破获一起疑难案件。
参考文献1、王乐,(2015)。 二代测序技术及其在遗传学中的应用[J]。 技术。DOI：10.16467/j.1008-3650.2015.05.0022、Yang,Y。, et al。(2014)。 Application of Next-generation Sequencing Technology in Forensic Science[J]。 Genomics, Proteomics & Bioinformatic。DOI：10.1016/j。gpb.2014.09.0013、权冰娥等。(2017)。 新一代DNA测序技术在实践中的应用及其研究进展[J]。 辽宁学报,DOI：CNKI:SUN:LIJZ.0.9
str
鉴定的原理
STR
鉴定是基于
DNA
技术的一种生物学分析方法。
STR
是指“短串联重复序列”
（
Short
Tandem
Repeat
），也称微卫星序列（
Microsatellite
），是一种高度多态性的
DNA
序列。
该方法可以通过对个体
DNA
中的
STR
片段进行扩增
PCR
反应，并对扩增产物进行电泳分离
和检测，来确定个体的
DNA
基因型和遗传信息，进而进行认定和鉴定。
具体的原理如下：
根据
DNA
序列信息，选定待鉴定的目标
STR
基因座。
人类基因组中有数以千计的
STR
基因座，其中一部分已被广泛应用于基因鉴定领域。
根据不同的需要，可以选用不同数量和种类的
STR
基因座来进行鉴定，通常至少选用
13
个
STR
基因座以确保准确性和可靠性。
制备待检测的
DNA
样本。
DNA
样本可以来源于血液、口腔拭子、头发等物质中提取得到的
DNA
。提取
DNA
的过程
需要注意消毒、防止外源
DNA
的污染等操作。
通过
PCR
技术扩增
STR
基因座。
PCR
技术可以扩增目标
DNA
片段，从而得到足够数量和浓度的
DNA
分子。
PCR
的过程中
采用包含特定引物的反应体系，在恰当的条件下进行
PCR
反应，选择合适的
PCR
参数来保
证
PCR
反应的特异性和灵敏度。
4、
对
PCR
产物进行电泳分离。
扩增后的
PCR
产物是由不同大小的
DNA
分子组成的混合物。通过将
PCR
产物在琼脂糖
凝胶上进行电泳分离，便可将不同长度的
PCR
产品分离开来。电泳过程中需要注意电场的
选取、电泳时间等因素。
5、
通过荧光标记的探针对
PCR
产物进行检测。
为了识别不同基因型，通常在
PCR
反应中加入荧光标记的探针，对
PCR
产物进行检测。
这种荧光标记的探针可以与
PCR
产物内的标记区域特异性结合，产生荧光信。经过荧光
检测后，便可确定个体基因型和遗传信息。
在进行
STR
鉴定时，需要比对待鉴定样本的的基因型信息和已知的基因座位于试验数
据库中的基因座型信息，以确定个体的身份或亲缘关系。对于
DNA
样本质量不佳或者污染
等问题，在实验中进行质控和比对的过程中要注意防止误判，从而确保鉴定结果准确可
靠。
与亲子鉴定常染色体STR基因座比较，Y-STR分型的学应用具有以下特点。
1亲子鉴定Y染色体为男性所有，对单拷贝Y-STR基因座，每个男性个体仅有一个等位基因，因此Y-STR分析在鉴定中的特殊意义在于混合斑痕中推断男性个体的更少人数；而多拷贝Y-STR基因座，每个男性可有一到多个等位基因，且分型结果中单峰和多峰间呈明显的剂量效应关系。
2亲子鉴定Y-STR呈父系遗传特征，只能由父亲传递给儿子，同一个父系的所有男性个体均具有相同的Y-STR单倍型（除非发生突变），故在父系亲缘关系鉴定中有一定的使用价值。
3在减数分裂过程中，Y-特异性区不发生重组，所有亲子鉴定Y-STR基因座均连琐遗传，故不能采用乘法原则将各基因座等位基因频率相乘，而应将所有Y-STR基因座分型结果视为一个单倍型，再根据被测男性所在群体的单倍型频率分布评估证据价值。
4评估亲子鉴定Y-STR鉴别能力的指标是遗传差异度（GD）。GD=1-Pi。GD值即Y-STR的个体识别能力DP值，数值也等于其非父排除率（PE）。
1、STR及其学应用及其学应用蔡福营2007.2.8一、 STR研究发展过程人类基因组遗传标记发展过程 代遗传标记 RFLP 第二代遗传标记STR 第三代遗传标记SNP用于个体识别的遗传标记的发展19851990199419961998200020021992Capillary electrophoresis of STRs first describedFirst STRs developedFSS QuadruplexFirst mercial fluorescent STR multiplexesCODIS loci definedSTR typing with CE is
2、 fairly routineIdentifiler 5-dye kit and ABI 3100PCR developedUK National Database launched (April 10, 1995)PowerPlex 16 (16 loci in single amp)2006: DNA is an important part of the criminal justice system20042006Y-STRJustice for All Act ($1B over 5 years)RFLPDQA1 & PM (dot blot)Multiple
3、x STRsmtDNAGill et al。 (1985) Forensic application of DNA fingerprints。 Nature 318:577-9领域STR发展前景/nij/pubs-sum/183697、htm美国国家隐私局（national institute of justice）调研报告2000年11月份评估DNA证据在未来 2, 5, and 10 years的发展前景结论STR typing is here to stay for a few years because of DNA databases
4、 that have grown to contain millions of profiles学遗传标记的发展方向 提供更多信息的STR检测试剂盒（新的位点和其它生物学特征） miniSTR（迷你STR，长度较短，100bp左右） SNP（与个体特征相关如肤色、毛发等的单核苷酸多态性位点）二、 STR生物学特征 STR，short tandem repeat,短串联重复序列，微卫星（microsatellite），SSR (simple sequence repeat) 结构特征：序列重复，分为简单重复（simple）和复杂重复（plex） 分布于基因之间 STR基因座命名原则ST
5、R是重复单位长度为2-6核苷酸的重复DNA序列 Dinucleotide (CA)(CA)(CA)(CA) Trinucleotide (GCC)(GCC)(GCC) Tetranucleotide (AATG)(AATG)(AATG) Pentanucleotide (AGAAA)(AGAAA) Hexanucleotide (AGTACA)(AGTACA)High stutterLow stutterYCAIIDYS44845%345） 重复长度越长，stutter越高 Stutter产量依次减小（主带12） 导致混合样本分型困难影子带的产生(图片改为gene8)True allele (
6、tetranucleotide repeat)n-4stutter productn+4 stutter productGATAGATACTATCTATCTAT35123122Insertion caused by slippage of the copying (top) strandRepeat unit bulges out when strand breathing occurs during replicationDeletion caused by slippage on the copied (bottom) strandGATAGATAGATACTATCTATCTAT35123
7、CTATCTAT56123GATA54CT ATOccurs less frequently (typically 2%) often down in the “noise” depending on sensitivityTypically 5-15% of true allele in tetranucleotide repeats STR loci不依赖模板的加A作用 Taq polymerase具有不依赖于模板在扩增产物的3末端加一个核苷酸（通常是A）的性质。具有高保真性的Taq酶例外。 反向引物的5端如果是G，可以增加加A的效率，也可以添加一个6核苷酸的tail PCR反应程序更后6
8、0度或72度保温1545分钟 酶活力不够，可能导致加A效率低，出现双峰现象，（如：过量模板可能导致，体系中含有反应抑制物等）Inplete adenylationD8S1179-A+A-A+A-A+A-A+AAA+A+A-A+A+A-A5-CCAAG5-ACAAGLast Base for Primer Opposite Dye Label(PCR conditions are the same for these two samples)5末端核苷酸对加A效率的影响Promega includes an ATT sequence on the 5-end of many of thei
9、r unlabeled PP16 primers to promote adenylationsee Krenke et al。 (2002) J。 Forensic Sci。 47(4): 773-785/biotech/strbase/PP16primers。htmD3S1358VWAFGA-A+A10 ng template (overloaded)2 ng template (suggested level)DNA Size (bp)Relative Fluorescence (RFUs)off-scaleFigure 6.5, J。M。
10、Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition 2005 Elsevier Academic Press过量模板可能导致加A不完全Microvariant off ladder现象重复次数不是基本重复单位的整倍数 或者序列跟基本重复单位不同或者这两者同时存在非整倍重复的等位基因命名方法：完整重复数点部分重复数 (Bar et al。 Int。 J。 Legal Med。 1994, 107:159-160)例子: TH01 9.3 allele: TCAT4 -CAT TCAT5Deletion of T三等位基因（Three-Peak Patte
11、rns）类型类型2三个峰高度相似主要发生于TPOX and D21S11类型类型1两个峰高度之和与第三个峰高相同D18S51主要发生于D18S51 TPOXClayton et al。 (2004) A genetic basis for anomalous band patterns encountered during DNA STR profiling。 J Forensic Sci。 49(6):1207-12141137样本GE16A检测结果STRBase中的微变化和三基因案例Off-Ladder AllelesTri-Allelic Patternshttp:/。cstl。
12、/biotech/strbase/var_tab。htmCurrently 328 at 13/13 CODIS loci + F13A01, FES/FPS, Penta D, Penta E, D2S1338, D19S433Currently 80 at 13/13 CODIS loci + FES/FPSNull alleles（无效等位基因） 样本DNA中含有含有该等位基因，但是由于没有被扩增和检测到，由于引物结合部位发生突变导致。 能够导致杂合子表现为纯合子，影响了DNA数据库比对 不同引物体系检测同一样本可能得到不同结果 新的STR检测试剂盒在应用之前需要与已有产
13、品进行大量的比对试验 Goldeneye16A 与Identifiler和PowerPlex16 比对目前没有发现这一现象*8866 8Allele 6 amplicon has “dropped out”Imbalance in allele peak heightsHeterozygous alleles are well balanced引物结合部位发生突变对扩增的影响没有突变没有突变结合位点结合位点3端突变端突变 (allele dropout)结合位点中部突变结合位点中部突变Butler, J。M。 (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition, F
14、igure 6.9, Elsevier Academic Press 遗传突变 mutaiton13,1610,1610,1413,1610,1510,14无突变时遗传规律父系突变图谱为某图谱为某06Q248亲子鉴定三联体样本亲子鉴定三联体样本D8S1179位点位点父母子等位基因由亲代向子代遗传过程中不遵循孟德尔遗传定律等位基因由亲代向子代遗传过程中不遵循孟德尔遗传定律突变特点 突变普遍存在，发生在生殖细胞减数分裂过程中 突变率通常为1/1000减数分裂 父系突变通常高于母系突变 VWA, FGA, and D18S51突变率更高 TH01, TPOX, and D16S5
15、39突变率更低商业化STR分型产品 ABI公司（美国），国内场占有85左右，？ Promega公司（美国），国内场占有15左右 其他外国公司（德国、澳大利亚） 公安部第二研究所（鉴定中心） 江西中德生物 珠海科登（codon）?目前研发的公司和机构13个个CODIS核心核心 STR Loci 及其染色体定位及其染色体定位CSF1POD5S818D21S11TH01TPOXD13S317D7S820D16S539D18S51D8S1179D3S1358FGAVWAAMELAMEL主流产品STR位点比较13 CODIS CORE STR SITESAmelD2D1913 CODIS C
16、ORE STR SITESAmelP DP E11 CODIS(TH01TPOX)AmelD2P ED6ABI IDPP16GE16ADNA Typer1511 CODIS(TH01TPOX)AmelD2D19D6D12ABI ChinaGoldeneye 16AD5110-160D13175-210D7215-250D16260-310FGA320-450FAMHEXTMRCSF320-360D3110-150TH01155-190D8195-250TPOX260-300PentaD370-450Amel106-112Vwa120-170D21200-260D18280-360PentaE3
17、80-480D5110-160D13175-210D7215-250D16260-310CSF320-360PentaD370-450FGA320-450D8195-250TPOX260-300AVwa120-170D3110-150TH01155-190D21200-260D18280-360PentaE380-480Promega PP16 kit FAMJOETMRD5155-205D13205-250D7251-300D16260-300CSF300-350D2305-370FGA210-360D8120-180D12215-275AVwa151-215D3100-150D6120-2
18、00D21185-250D18280-360D19100-150ABI China kit FAMNEDVICJOEDNA Typer15D5120-165D13155-190D7240-280D16255-300FGA330-CSF285-340D3100-150D6100-165D8195-250D2340-AVwa170-225D21170-230D18230-310PentaE300-420FAMHEXTMR在研或即将研究项目 将ABO血型检测与STR分析整合，世界首创（SNP+STR），同时扩增效果良好 不适宜分析血型的样本（如精斑、唾液、骨骼等）也可以判断血型 血型数据是丰富的资源，值得利用 缩小样本筛查范围，减少检测样本数量，节约经费ABO+16AGoldeneye 18A 兼容已有的数据库信息 一次反应获得更多的信息 更高的个体识别率和非父排除率13 CODIS CORE STR SITESAmelD2D1913 CODIS CORE STR SITESAmelP DP E13 CODIS CORE STR SITESAmelP DP ED2D19Y STRAutosom
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2024-03-26
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