dna
合成方法
DNA
合成方法
DNA
合成是一种重要的生物技术方法，它可以合成具有特定序列的
DNA
分子。
DNA
合成技术的发展为基因工程、合成生物学以及其
他生物学研究提供了强有力的工具。本文将介绍几种常见的
DNA
合成方法。
一、化学合成法
化学合成法是更常用的
DNA
合成方法之一。它基于化学合成原理，
通过逐个添加核苷酸单元来构建目标序列的
DNA
分子。合成时，
先将核苷酸单元与保护基团连接，然后通过去保护反应去除保护基
团，再与下一个核苷酸单元连接。重复这一过程直至合成目标序列。
更后，通过脱保护反应去除所有保护基团，得到纯净的
DNA
产物。
化学合成法的优点是合成速度快、效率高，适用于合成短序列的
DNA
分子。然而，该方法对于长序列的
DNA
合成存在困难，因为
长序列的合成过程中易产生错误和杂质。
二、酶法合成
酶法合成是另一种常见的
DNA
合成方法。该方法利用
DNA
聚合酶
酶活性，在模板
DNA
的引导下，逐个加入适配体和核苷酸单元，
更终合成目标序列的
DNA
。酶法合成具有高度特异性和准确性，可
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DNA的合成过程是非常艰辛的。研究员Kosuri表示：“难就难在，DNA合成过程中，约有5%的时间，会损失掉随机合成的一个DNA。而且，不仅合成困难，就连读取DNA也是一个问题。如果有一种编码技术能够避免这种损失，那么DNA储存技术就会变得简单得多，也利索得多。”
美国科学杂志发布的这项研究，的确实现了这种编码技术。研究员Kosuri表示，这项技术可以让DNA合成过程中出现的失误容易让人接受。这要归功于一种特殊的编码技术，而用这项技术传送数字信息，通常能够适应连接中断的情况发生，比如在智能手机上播放Youtube视频。Erlich表示，这就意味着，这种编码技术能够处理那些比研究中运用的DNA质量低得多的DNA。
研究员Kosuri没有参与该项研究，但他是上述2012年哈佛研究报告的作者，如今是加利福尼亚洛杉矶分校（UCLA）的一名生物化学教授。
苏黎世联邦理工学院化学工程师Grass也参与了这项研究，他表示，研究团队成功地在DNA中储存并且恢复了一个操作系统，是个“优雅的成就”。他还说：“我每天都在‘运用’DNA，所以我明白这项工程必须要万无一失。” Erlich表示，他们是故意把那个操作系统放进DNA的。”如果不把文件完美地恢复，那么就可能会损毁某些内容。但我们就是要证明我们不怕把这种可能会损毁的内容放进DNA。”
Kosuri也同意这种方式十分高效：“我认为他们采用了正确的实验测验算法。他们选对了算法，而且看起来很奏效“。
在化学工程师Grass看来，合成DNA的成本比编排DNA的成本还要大。他说：“虽然编排DNA的成本太高，无法实际使用，不过现在有了纳米微孔 (nanopore) 插入计算机进行DNA编排的技术，所以它的成本越来越小了。但是，合成DNA的成本依旧十分之高。”
研究员Erlich憧憬在未来，有人可以发明一种“专门用于DNA储存的工序，方便我们快速合成劣质DNA”，从而减少成本。他说：“我们可以质量参差不齐的DNA先提取出来，然后再根据编码方式来逐步对其进行纠正。这是我们未来的研究方向”
现在的研究是一个良好的开端。研究员已经在DNA储存了许多内容，它们能灵敏地减少储存错误，其中包括：一个操作系统、一个电脑病毒、一张价值50美元的亚马逊礼品购物卡、1895年于法国上映的世界上部电影火车到站（Arrival of a train at La Ciotat）、航天飞行器“先驱者”（Pionner）的一块载有人类讯息的镀金铝板以及美国数学家、信息论的创始人克劳德·艾尔伍德·香农（Claude Elwood Shannon）于1948年发表的一篇研究报告。
1953年4月25日，James Watson、Francis Crick在Nature上发表了有关DNA双螺旋结构的论文，自此DNA结构之谜得以破解，生命科学进入了分子生物学阶段，DNA合成技术也逐步登上历史舞台。
DNA合成主要包括单链寡核苷酸合成和双链基因合成。根据实现方式的不同，主流的DNA合成技术可以分为四代。初代DNA合成采用亚磷酰胺三酯合成法，是通过化学方法构建一串碱基，以形成一条单链的片段，然后将这些片段连接在一起，形成双链DNA。第二代DNA合成技术是基于芯片技术，包括喷墨法、光化学法及电化学法。第三代DNA合成技术是超高通量合成技术，也就是半导体结合电化学法。
近年来，随着行业的发展，对于庞大基因组的合成需要更高效率、更高精度、更低合成成本的DNA合成技术，由此基于生物酶催化的第四代DNA合成技术崭露头角，成为DNA合成未来发展的重要方向，吸引了众多研究人员的目光。
2018年，合成生物学大牛Jay D。 Keasling，通过在核苷酸的碱基端添加修饰基团，使底物与末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）连接在一起，采用交联体的策略合成DNA，随后，George Church利用TdT在DNA链3’末端掺入多个核苷酸，进行DNA存储研究。近期，国内同样实现了酶促DNA合成的重大突破。2022年2月，国内科学院天津工业生物技术研究所江会锋研究员带领的新酶设计团队，利用改造获得的合成酶创建了两步循环酶促DNA合成技术，将DNA合成的平均准确率提高至98.7%，与商业化的DNA化学合成法准确率相当，成为酶促DNA合成领域的重大突破，相关论文“Enzymatic DNA Synthesis by Engineering Terminal Deoxynucleotidyl Transferase”发表于ACS Catalysis。
图1、在从头DNA合成中利用工程化TdT酶 来源：ACS Catalysis
表1、历代DNA合成技术
来源：公开资料，凯莱英整理
DNA设计合成是推动生命科学及其相关领域发展的关键共性底技术。常规的遗传操作技术仅能对已有的DNA序列进行有限的改造，而DNA合成技术则可从头“书写”生命信息，从另一高度提升人们对生命体理解、预测和操控的能力。根据BCC Research的报告，全球寡核苷酸合成场规模将从2021年的61亿美元增长到2026年的102亿美元，复合年增长率（CAGR）10.7%。另据Grand View Research报告预测，2021年基因合成场规模约为17.7亿美元，预计到2028年增长为55.8亿美元，复合年增长率为18.1%。在全球场中，DNA合成仪生产商及服务商主要包括：Codex DNA、Twist Bioscience、Molecular Assemblies、DNA Script等等。
Codex DNA：打造合成DNA和mRNA的“迷你工厂”
Codex DNA专注于使研究人员能够快速、准确和可重复地构建或“编写”高质量的合成DNA和mRNA，其核心系统BioXp™是个商用的按钮式、无人值守的端到端自动化工作站。只需几分钟的设置时间，可在8小时内将数字DNA序列转化为endpoint-ready的合成DNA，在24小时内合成mRNA。利用BioXp™系统，能够从头合成长度高达7.2kb碱基对，并能纠正错误基因或合成多型DNA,使用该公司的Gibson Assembly®技术，无需动手就能将它们克隆到定制载体中。
Twist Bioscience：二代DNA合成成本，布局DNA储存
Twist Bioscience成立于2013年，其核心技术为基于半导体的合成DNA制造工艺，具有高通量硅平台，可以使DNA合成所需的化学成分微量化，从而提升通量并降低成本。基于硅芯片DNA的合成技术先进且成本优势显著。一方面将反应所需化学试剂体积压缩了100万倍，另一方面将合成通量提高1000倍，从而实现在与96孔板相似大小的10000孔硅片上并行合成9600个基因。这使Twist能够以更大规模和更低成本合成DNA。目前，公司每天可以合成1TB的DNA，报价低至0.03美元/碱基，而传统供应商的提供成本约为0.10~0.30美元/碱基。较低的DNA合成成本也为公司向DNA储存等业务拓展提供了可能。2021年5月，Twist Bioscience在其开发用于数据存储的DNA芯片上成功合成了200个碱基对的寡核苷酸，是有史以来硅片更小规模上合成的更长DNA。目前公司正努力将合成成本降至1000美元/PB，实现商业应用。
Molecular Assemblies：正在联手GE生产基于核酸的疫苗和药物
Molecular Assemblies成立于2013年，位于圣地亚哥。通过安捷伦科技公司等投资公司，Molecular Assemblies在2021年4月完成的A轮融资后，筹集了3080万美元。这家初创公司在开发一种DNA合成技术平台，只需要三个步骤就可以合成高质量的特定序列DNA。Molecular Assemblies希望瞄准DNA的所有潜在场和应用，包括农业、生物燃料、DNA信息存储、纳米级DNA、基因电子和治疗学。该公司正在与通用电气（GE）研究院合作，以实现基于核酸的疫苗和治疗药物的生产。
DNA Script：合成96个寡核苷酸需6到13个小时
DNA Script成立于2014年，专注酶法DNA合成，DNA Script采用TdT催化的DNA合成法，其逐步连接的单步产率已达到与化学法相等的99.5%，在200个单体长度下合成的效率和保真性都达到了和经典的亚磷酰胺合成法相当的水平，同时合成周期极大缩短、合成过程安全无害。2021年6月，DNAScript推出了首个酶法台式DNA合成仪Syntax，该款DNA打印机可按需生产合成DNA的寡核苷酸，其合成寡核苷酸的速度很快，合成96个寡核苷酸需要6到13个小时。目前，DNA Script正在与诊断分析领域的开发人员合作设计工具，帮助科研人员深入研究重要的科学问题，包括如何治疗脱发等。
随着DNA合成技术的不断发展，染色体或基因组的合成、人工设计基因组的创造、可控细胞工厂与人工生物的构建都已为可能。行界对高效保真的DNA合成技术、高通量的组装与错误校正体系开发等基因合成相关技术的需求更为强烈。而国内DNA合成领域亦处于黄金发展期，场规模有望达到全球场规模的三分之一。DNA合成技术在生物医疗、生物制造、DNA存储等诸多领域具有广阔应用前景与巨大场潜力。
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DNA,技术,基因,规模
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