一、包虫简介
包虫又名棘球蚴，是一种古老的人畜共患性寄生虫，主要由人感染棘球绦虫的幼虫所致。该疾分为囊型包虫和泡型包虫两种，分别由细粒棘球蚴和多房棘球蚴感染引起。两种绦虫都必须在哺乳类动物体内寄生才能完成生活史，细粒棘球绦虫的终末宿主一般为犬和狼；多房棘球绦虫的终末宿主一般为狐狸、犬和狼。
近年来，包虫呈全球性分布，我国包虫主要流行于西北牧和半农半牧地，其中以新疆、西藏、宁夏、甘肃、青海、内蒙古、四川7省更为严重。根据文献报道，我国西部人群包虫的感染率为3.1%～ 31.5%，患率为0.5%～5.0%，其中青藏高原部分地人群患率为5.0％～10.0％。据2010年原国家卫生和计划生育委员会“防治包虫行动计划(2010—20)”，我国西部地包虫平均患率为1.08％，受威胁人口约为6600万，每年造成直接经济损失30亿元。
二、包虫诊断依据
根据现行包虫诊断标准，包虫的临床诊断要综合考虑：流行学史、临床表现、影像学检查、实验检查及原学检查几个方面。
1、流行学史
该部分主要考虑患者是否有在流行的居住、工作、旅游或狩猎史，或与犬、牛、羊等家养动物或狐、狼等野生动物及其皮毛的接触史；在非流行有从事来自流行的家畜运输、宰杀、畜产品及皮毛加工等暴露史。
2、临床表现
患者主要的临床表现为棘球蚴的囊占位所致的压迫、刺激、囊破裂引起的一系列症状，囊性包虫可发全身多个器官，以肝、肺为常见；泡型包虫原发灶几乎都位于肝脏。
3、影像学检查
主要为通过B超扫描、X线检查、计算机断扫描或磁共振检查发现占位性变。
4、实验检查
通过酶联免疫吸附试验、间接红细胞吸附试验、PVC膜快速ELISA、免疫印迹技术等方法对包虫相关的特异性抗体、循环抗原、免疫复合物进行检测。
5、原学检查
在手术活检材料、切除的灶或排出物中发现棘球蚴的囊壁、子囊、原头节或头钩。此为包虫的确诊方法。
三、相关检测产品介绍
对来源于患者或疑似患者人体样本中的包虫感染相关生物标志物进行检测是辅助诊断包虫的重要手段。相关生物标志物包括特异性抗体、循环抗原、免疫复合物、原体核酸等。我国已批准四个包虫抗体检测试剂，产品信息见表1、已批准产品均采用免疫学方法对样本中的原体抗体进行检测，免疫学检测有其自身的局限性，一方面，由于细粒棘球蚴和多房棘球蚴两种原体自身抗原存在交叉的特点，导致应用抗体检测来分囊型/泡型效果欠佳；另一方面，抗体检测无法分现症感染与既往感染。随着检测技术的进步，原体核酸及其游离DNA（cfDNA）检测为感染的辅助诊断提供新的思。目前，上尚无包虫核酸检测相关的产品，我国已有细粒棘球蚴和多房棘球蚴核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）产品获批进入国家药监局创新医疗器械特别审查程序，该产品临床应用的安全有效性仍然在验证过程中。
表1 我国已批准的包虫检测试剂
四、原体相关游离DNA（cfDNA）简介
近年来，随着对寄生虫血浆游离DNA（cfDNA）的研究，cfDNA在寄生虫的检测中得到了快速发展，目前已有应用cfDNA检测对疟原虫、弓形虫、利士曼原虫、锥虫、血吸虫等寄生虫感染进行辅助诊断的报道。针对寄生虫感染后cfDNA的来源，可能是虫体或虫卵的细胞或碎片在增生、成熟、脱落、腐烂、崩解等过程中主动分泌或被动释放出内部的DNA进入宿主体液循环系统产生；也有研究表明绦虫主动分泌的外泌体是寄生虫感染后患者体内出现虫源DNA的重要原因。基于上述研究，检测样本中细粒棘球蚴和多房棘球蚴两种原体游离DNA为该疾的辅助诊断提供了理论基础。
五、检测游离DNA的考量
寄生虫源cfDNA的检测在临床应用中存在一定优势，一方面，可根据特异性的基因序列对两种不同种类的原体进行分型，从而达到对疾进行分型的目的；另一方面，患者样本中存在寄生虫DNA在一定程度上可提示患者可能感染相关原体。然而，作为一个新的标志物，能够应用于临床，在现有的理论基础上，还应进一步研究。一是，应进一步明确患者不同疾进展阶段血浆游离DNA浓度的变化，并以此为基础，确定该标志的临床预期用途（如：疾早、辅助诊断、鉴别诊断及治疗监测等）；二是，应依据标志物拟定的预期用途，进一步对该标志物进行临床验证，临床研究应考虑入组人群、对照方法等，如该标志用于疾的鉴别诊断，则入组人群应为包虫疑似人群，其中不同大小占位性变例、不同灶退变（CE4、CE5）例、不同基因型例等均应入组，此外还应考虑非包虫例的干扰。用于疾鉴别诊断用途的临床研究其对照方法应为疾确诊的标准即原学检查。
六、
我国包虫防控形势严峻，包虫流行多为相对偏远、落后的地，目前包虫的诊断很大程度上依赖于影像学和原学，这不仅对临床专注技术水平要求较高，还存在一定程度的误诊、漏诊的风险。血浆游离cfDNA检测操作较为简便，结果易于解读，如能按预期应用于临床，将对包虫的诊断起到积极作用。
参考文献：
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[2] 安康卫生行业标准。 包虫诊断标准(WS 257–2006)。
[3] 何顺伟，李晓燕，赵瑞雪等，体液游离寄生虫DNA在寄生虫诊断中的研究进展。国内人兽共患学报.20，33（2）：163–169、
（责任编辑：申杨）
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：刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生的重要机会致性原虫(opportunistic proto－zoan)，因其生活史和致机理复杂，至今为止对弓形虫的诊断仍缺乏敏感的特异的检测手段，该文旨对近年来弓形虫抗原基因与弓形虫临床诊断更新的研究进展作一概述。
关键词：弓形虫 抗原基因 诊断
中图分类：R3 文献标识码：A 文章编：1007-3973(2011)003-056-03
1、弓形虫表面膜抗原(surface antigen，SAG)基因
1.1 表面蛋白P30(SAGl)基因
弓形虫速殖子表膜是宿主免疫系统识别和杀伤的主要部位，含有各种不同的表面抗原，其中表面蛋白P30保护性实验显示具有很强的免疫原性及免疫保护性，是诱导宿主免疫应答的主要靶抗原，可刺激机体产生IgG、IgM、IgE、IgA及sIgA，并可诱导产生一些细胞因子，其抗原特异性的CD8T细胞能直接杀伤细胞外弓形虫，对弓形虫感染的腹腔巨噬细胞亦具有细胞毒性。陈沙丽研究表明，SAGl基因在弓形虫入侵宿主的过程中发挥了双重作用，它不仅在介导弓形虫速殖子入侵宿主细胞的过程中发挥作用，并且还可以引发宿主体内强烈的抗原抗体反应，此种免疫原性使其成为诊断性抗原与免疫性抗原的重要候选基因。Holliman等将份抗体阳性患者的移植心脏活检组织提取DNA后，用PCR方法扩增P30基因，结果8份呈阳性，而用组织学检查却只发现2例。Savedra曾根据P30基因设计引物后应用PCR或斑点杂交技术均检测到弓形虫DNA。因此，SAGl基因不仅具有疫苗研究的价值，还具有很高的免疫诊断价值。蔡亮等从刚地弓形虫RH株基因组DNA中扩增SAGl基因编码序列，当扩增到1030bp的全长SAGl基因时在原核系统中经诱导表达出一分子量约37000大小的融合蛋白，验证了SAGl是弓形虫主要的表面抗原，原核表达的SAGl融合蛋白在弓形虫的免疫诊断中具有明显的潜在应用价值，为进一步研制弓形虫免疫诊断试剂盒打下基础，Chen等通过构建弓形虫P30基因重组表达质粒并纯化其表达产物，显示该质粒表达的蛋白具有特异的免疫反应性，能被弓形虫人血清所识别，用其制作的诊断试剂盒诊断弓形虫感染有较高的敏感性和特异性。李越希等通过计算机分析P30蛋白的抗原表位及疏水域，选定了P30蛋白的强抗原表位，利用基因工程技术在大肠杆菌中进行了高表达。高表达的P30蛋白抗原表位以包涵体形式存在，易于纯化，所获得的P30蛋白抗原表位有较好的抗原特异性，可用作抗原检测弓形虫抗体。将该抗原表位用于孕妇检测，对优生优育有重要意义。
表面蛋白P22(SAG2)基因
研究表明，抗P22表面抗原的抗体能阻止弓形虫定位固定于宿主细胞的表面，从而阻止其侵入细胞内。Mishima等研究发现，P22蛋白能刺激机体产生部分免疫应答，该基因体外表达研究结果表明：P22可与谷胱甘肽s转移酶(GST)呈融合蛋白形式大量表达，可与人血清1gG抗体反应，故P22是希望值较高的弓形虫诊断用抗原。Prince等首先在大肠埃希菌中表达了P22基因全长序列的半乳糖苷酶融合蛋白，该融合蛋白能被7名急性感染者中的5名患者及5名慢性感染者中的2名患者血清IgG抗体识别，显示了重组P22抗原的诊断价值。Li等使用4种重组抗原(rP22、rP25、rP29、rP35)ELISA检测孕妇患者缸清，20例急性患者中有例呈阳性，有效率90％：70例慢性患者有69例呈阴性，有效率98.6％；故rP22能有效分孕妇的急、慢性感染。Huang等用rP22ELISA检测中间宿主猫血清，42只阳性猫中有39例LAT(乳胶凝集试验)试验阳性：0只ELISA阴性猫，LAT检测也全阴性。Lyons等。运用竞争性反转录PCR，研究速殖子期特有的SAG2A、SAG2B，缓殖子期特有的LDH2基因表达水平，根据速殖子、缓殖子的相互转化判断疾的进程。预示弓形虫P22抗原基因工程研究将为免疫诊断带来突破性进展。
1.3 表面蛋白P43(SAG3)基因
杨丽萍等采用弓形虫P43基因作为靶基因进行PCR扩增，发现P43具有很高的特异性和敏感性。另一研究发现，在近期感染的弓形虫患者血清中，抗P43抗体滴度很低，但慢性弓形虫患者的抗P43抗体滴度很高，表明该蛋白在弓形虫诊断方面有一定价值。周永安等利用ELISA和PCR方法对30例异基因造血干细胞移植者进行异基因造血干细胞移植受者检测，应用PCR和ELISA方法检测弓形虫表面抗原P43基因和其抗原，其阳性率分别为16.6％和.3％；作为阴性对照的20名正常对照组其结果均为阴性。由此得出：体外扩增弓形虫P43基因的方法具有准确、快速、特异和敏感的优点，因为其适用于临床的各种不同标本，PCR被认为是对弓形虫感染做出诊断很有价值的一种手段。可作为白血患者弓形虫感染很有价值诊断的方法，也预示着应用P43基因进行PCR检测可能替代其他费时的检测方法，有着广阔的应用前景。
1.4 表面蛋白P35基因
张仁利等应用弓形虫EST基因库合成扩增P35基因片段的引物，结合5’和3’末端eDNA快速扩增法，进行P35基因5’和3’末端cDNA的扩增，TA克隆RT-PCR产物及DNA序列分析，P35蛋白的羧基端有极高的亲水性，并含有T、B细胞的表位，显示了P35用于诊断和疫苗开发的可行性，但目前P35蛋白主要用于诊断弓形虫速殖子感染。Lj等将P35基因插入CKS在Ecoli中表达，用ELISA方法检测孕妇体内的抗P35IgG抗体。结果发现，弓形虫急性感染的孕妇，其体内的抗P35IgG抗体滴度非常高与弓形虫慢性感染孕妇体内的抗P35IgG抗体滴度之间有显著性差异，提示抗P35抗体可作为弓形虫近期感染的血清学标志。吕斌等构建了可表达P35-GST的JMl09细胞株，在对60例血清进行IgM-ELISA分析时发现P35-GST可明显分近期感染和既往感染。因此，P35一GST在弓形虫的早期诊断中将有很大的应用前景。
1.5 表面蛋白P(SAG4)基因
P普遍存在于急慢性弓形虫感染血清中，可引起机体早期细胞及体液免疫应答，抗原性很强。田春林等。采用PCR体外扩增方法成功获得SAG4基因575bp片断，经生物信息学分析，预测其编码的氨基酸可能具有一定的生物学活性，作为弓形虫的诊断抗原有一定的研究价值。
1.6 表面蛋白P23(SAG2B、GRAl)基因
Cesbron-Delauw等。通过免疫印迹ca2孵育试验发现，此种蛋白抗原易与慢性患者血清反应而不易与急性感染患者血清反应。因此，重组P23所表达的蛋白可作为诊断慢性弓形虫感染的探针；也说明P23蛋白是慢性弓形虫的一个分子标志，在慢性弓形虫的诊断上具有重要意义。
2、其他抗原基因
2.1 虫体棒状体蛋白(rhoptry protein，ROP)基因
已报道的ROP有8种，每种ROP分子的结构、生物学功能及其免疫学效应大小都有所不同，国内研究较多的是弓形虫棒状体抗原2(rhoptry protein 2、ROP2)，将ROP2用于弓形虫的血清学诊断的ELISA试验，其包含有被多数免疫个体所识别的T细胞表位，敏感性可达89％，显示出作为诊断抗原和作为疫苗候选抗原的巨大潜力。
致密颗粒(dense granules protein，GIlA)基因
现已知有10种不同的速殖子致密颗粒蛋白(GRAl-GRA10)，在弓形虫的诊断及免疫预防中具有潜在价值。更近发现的GRA7可与急性和慢性弓形虫感染的人血清发生反应，可作为诊断抗原和候选疫苗抗原。免疫化学分析证实GRA1为存在于速殖子及缓殖子的致密颗粒，可作为慢性感染的诊断抗原及制备弓形虫疫苗的成分。
2.3 微线体蛋白(microneme protein，MIC)基因
现已发现的弓形虫微线体蛋白有十个亚型(TgMICl，ZgMICl10)，其中TgMIC10可从弓形虫入侵的组织部位释放出来，而成为一种循环抗原。由于循环抗体出现于虫血症及其它抗体产生之前，且在慢性感染阶段已逐渐消失，根据急性期感染的速殖子中TgMIC10表达的相对水平的高低，直接检测IgMIC10对潜伏期，对急性期及免疫抑制状态的弓形虫诊断可能非常有用。
2.4弓形虫排泄／分泌抗原(ESA)基因
近期的研究主要通过体外培养法获取ESA，其多种成分均具有较强的免疫原性，可诱导细胞及体液免疫应答并产生抗弓形虫感染的保护作用，从而揭示弓形虫带虫免疫及免疫逃避机制有重要意义，对弓形虫的诊断及免疫预防、疫苗候选抗原的制备具有重要价值。
2.5 B1基因
Burg应用不同长度的B1质粒和总基因组DNA进行定量Southem印迹分析，表明B1基因重复达25至50倍，根据对每条带放射活性的更精确定量计算可知，在弓形虫基因组中B1基因的拷贝数大约有35个0、证明该基因是目前被公认为弓形虫高度保守，高度重复的基因之一，所以现在该基因通过扩增特异性B1DNA，成为检测弓形虫的理想靶抗原基因。
3、
弓形虫是一种感染率很高的寄生原虫，能引起广泛的共患。在我国，采用不同的方法调查，在不同的地感染率为0.3％～47.3％，患弓形虫的宠物是人类感染弓形虫的重要传染源。由于目前没有统一的诊断标准、缺乏敏感的特异的检测手段，国内也没有令人满意的弓形虫诊断试剂盒，故免疫学诊断和分子生物学诊断是当前采用较多的诊断方法。现阶段研究的热点是采用基因工程制备弓形虫SAG1重组抗原，虽然我国起步较晚，但在抗原分型研究、检测技术和制备技术方面的研究已取得一些突破性进展，特别是各种组织培养技术的建立，CA检测技术的建立、弓形虫基因文库的建立与DNA克隆选极其探针的制备，PCR的成功应用，抗原纯化技术的发展，都为大量获得弓形虫抗原和早期、快速、准确的诊断弓形虫奠定了良好的基础。相信随着生物信息学、分子生物学以及基因工程技术的日臻成熟、完善和发展，在不远的将来，随着DNA疫苗实验研究的不断深入，上述各种问题必将得到解决，弓形虫的诊断势必会取得丰硕的成果。
注释：
①Lufi BJ，Remington JS。AIDS metary。Toxoplasmic encephalitis[J]。Jlnfect Dis，88，7：1-6、
②Aosai F，Mun HS，Norose K，et a1、Protective immunity induced by vaccination with SAG I gene-transfected ceils ag-ainst Toxoplasma gondii-infection in mice[J]。Micromjol
当前，通常使用的RNA疫苗纯度分析方法为色谱或基因测序。然而，上述两种方法检测过程复杂，成本高，且检测耗时较长。Lsmart-sp1™单分子检测仪可通过使用设计的特定直径固态纳米孔芯片实现RNA疫苗样本中环状RNA与线性RNA分子的高分辨率分，从而实现RNA疫苗中环状分子纯度的快速定量分析。
图2、 RNA疫苗样本使用固态纳米孔检测的电流轨迹
2、炎症标志物C反应蛋白（CRP）浓度定量分析
C反应蛋白（CRP）是一种急性时相蛋白，由肝脏生成，当体内有炎症或其他多种疾时，CRP的含量水平会升高，因此，可通过血液检测来检查C反应蛋白的水平，评估体内炎症情况。目前，存在多种常规方法可用于检测CRP，包括免疫凝集法、免疫比浊法及酶联免疫吸附测定（ELISA）等。然而，这些技术由于耗时、昂贵、且需要经过培训的专注人员进行操作等。为了克服这些障碍，基于电化学、光学、比色法和压电原理生物传感器的开发受到了广泛的关注。由于Lsmart-sp1™ 采用的固态纳米孔可实现单个蛋白质水平的传感，检测限极低（可达到pg/μL）且检测快速，因此可实现C反应蛋白的快速定量分析。
图3、 C反应蛋白纳米孔检测示意图
3、 基于dcas9的弓形虫DNA检测
进行备孕前TORCH五项检查必不可少，其中弓形虫检测是更为重要的一项指标。感染弓形虫的孕妇对胎儿的健康发育影响很大，因此,需要对其进行快速的检测。当前的检测方法基本为采用免疫学检测等。
苏州丽纳芯生物科技有公司研发团队开发了一种基于dcas9蛋白的弓形虫DNA的快速检测方法。通过设计特定的sgRNA序列，结合CRISPR/dcas9体系，并采用自主研发的Lsmart-sp1™单分子检测仪进行高分辨、高特异性的检测。
4、蛋白质的磷酸化与糖基化检测
蛋白质翻译后修饰（PTM）调节几乎所有的细胞过程，而异常的PTM与人类的多种疾密切相关，使得特定疾与基因突变的关联变得非常复杂，甚至使基因组学驱动的个性化治疗无效。然而，蛋白质组学有潜力提供对疾生物学进行更全面的理解，并正在成为后基因组时代精准医学的新突破之一。蛋白质的磷酸化与糖基化是两种更为重要的PTM，成为学术界对癌症发机制、生物标志物和治疗靶点的发现以及工业界对靶向药物和疫苗的开发的广泛研究热点。磷酸化与糖基化后的蛋白质会发生结构或表面电荷的改变，因此，通过对这些改变进行高分辨的识别可实现对两种重要PTM的检测。
Lsmart-sp1™采用可控加工方法，可实现约2nm直径纳米孔的加工，可实现对蛋白质细小变化的高灵敏检测，是目前蛋白质翻译后修饰（PTM）检测更具前景的方法之一。
图4、 蛋白质磷酸化示意图
5、癌症相关EVs的定量分析
细胞外囊泡（EVs）是细胞在生理或理状态下，通过胞吞作用形成多泡小体后，通过细胞膜融合分泌到细胞外环境中的微小囊泡，其中直径范围在30-0 nm的EVs被定义为外泌体，对外泌体的研究是目前液体活检方向的三驾马车之一。外泌体的分泌量反应细胞的生理状态，当发生癌变时，外泌体的分泌会发生显著的增多，因此，对外泌体浓度的定量分析对癌症的早期诊断及预后具有重要的意义。
图5、 大直径（≥100 nm）纳米孔的SEM图
Lsmart-sp1™采用聚焦离子束（FIB）技术可进行直径大于0 nm的不同直径纳米孔孔道的加工，针对不同尺寸细胞外囊泡的单颗粒水平的检测，并进行浓度的定量分析。
（文：转自丽纳芯生物官微)
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2023-12-01
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