本发明属于学技术领域，具体涉及一种基于snp-str遗传标记的学复合检测试剂盒及其应用。
背景技术：
短串联重复序列（shorttandemrepeats,str）侧翼序列中的单苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,snp）被认为是有价值的系统发生遗传标记，可用于探索等位基因之间乃至人群之间的进化关系。相比于str，由str以及其侧翼的snp构成的snp-str单倍型包含更多的遗传信息，有利于更好的理解基因变异。通过使用snp-str遗传标记，疑难亲子鉴定案例可以得到更好的解决：结合snp-str单倍型信息，可以在str位点变异的情况下进一步计算亲权指数，从而给出肯定或否定的鉴定。
等位基因特异性聚合酶链式反应（allelespecificpolymerasechainreaction,as-pcr）技术可以特异性的针对snp位点中的一个等位基因进行扩增，结合电泳技术，能够对snp进行分型。当扩增片段中包含str位点时，结合电泳技术，即可同时得到snp和str的分型，从而得到snp-str单倍型分型信息。wang等人构建了包含三个snp-str位点的复合检测体系，且由于使用了as-pcr技术，此体系具备了一定程度的混合样本分析能力。公开为cn107385064a的专利申请中公开了一种同时扩增人常染色体snp和str位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用，通过在单管反应中复合扩增个snp位点，个str位点及基因座amelogenin，利用检测代遗传标记多态性位点(单苷酸多态性)arms-pcr方法和荧光检测技术的结合，开发了一管同时检测31个dna位点荧光试剂盒，该试剂盒对于解决领域的不均衡性混合样本，同一样本相同str分型的分，临床领域产前亲子鉴定，器官移植检测，产前疾诊断等具有广泛的应用前景。因此，开发多样化，多种类的基于snp-str遗传标记的复合检测试剂盒在个人识别和亲子鉴定具有重要意义。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种新的基于snp-str遗传标记的学复合检测试剂盒，试剂盒中snp-str位点的选择旨在使用受到广泛认可的，多态性高的str位点及其相邻的等位基因频率分布均衡的二等位snp位点，以使此系统达到足够高的个人识别率和亲权指数以及非父排除率，基于上述标准，本发明更终重新确认了不同于现有技术的个snp-str位点，并设计基于这个snp-str遗传标记的学复合检测试剂盒，采用本发明试剂盒，能达到了较同位点数str更大的个人识别和亲子鉴定系统效能。
为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现：
基于snp-str遗传标记的学复合检测试剂盒，所述试剂盒包括pcr反应体系，所述体系包含扩增以下个dna位点的引物，所述位点具体为：rs48470-d1s1656、rs58390469-d2s441、rs729592-d2s38、rs9853910-d3s3045、rs6565-csf1po，rs28562816-d6s477、rs2325399-d6s1043、rs16887642-d7s820、rs4961632-d9s925、rs2246512-d10s1248、rs752269-vwa，rs77312049-d12s391、rs28369-d16s539、
每个snp位点均紧密连锁一个str位点，且二者被同时检测。
每一个snp-str位点分别有2对等位基因特异性引物，故共有26对等位基因特异性引物。由于同一个位点的等位基因特异性引物会共用同一条与之对应的上游/下游引物，所以一个snp-str位点共有3条引物（2条等位基因特异性引物，1条对应的共用的上游/下游引物），共有39条引物，引物的苷酸序列如表1中seqidno：1-seqidno：39所示。
本发明中，所述正向引物和反向引物在pcr反应体系中的终浓度分别如表1中所示：pcr反应体系中，反向引物终浓度与对应的正向引物终浓度相同。
每个所述dna位点的两条正向引物5’端采用不同的荧光染料标记。具体的，dna位点rs16887642-d7s820、rs4961632-d9s925、rs752269-vwa，rs28369-d16s539、rs58390469-d2s441、rs9853910-d3s3045、rs28562816-d6s477、rs2325399-d6s1043的两条正向引物的5’端荧光标记为6-fam或tamra；dna位点rs48470-d1s1656、rs729592-d2s38、rs6565-csf1po，rs77312049-d12s391、rs2246512-d10s1248的两条正向引物的5’端荧光标记为hex或rox。
本发明中，将扩增个dna位点的引物分为两部分，这样，可避免位点的重叠，具体的：将正向引物seqidno：2、反向引物seqidno：1、正向引物seqidno：4、反向引物seqidno：5、正向引物seqidno：8、反向引物seqidno：7、正向引物seqidno：10、反向引物seqidno：11、正向引物seqidno：、反向引物seqidno：14、正向引物seqidno：16、反向引物seqidno：、正向引物seqidno：20、反向引物seqidno：、正向引物seqidno：23、反向引物seqidno：22、正向引物seqidno：25、反向引物seqidno：26、正向引物seqidno：29、反向引物seqidno：28、正向引物seqidno：31、反向引物seqidno：32、正向引物seqidno：35、反向引物seqidno：34、正向引物seqidno：37、反向引物seqidno：38组成引物混合物a；正向引物seqidno：3、反向引物seqidno：1、，正向引物seqidno：6、反向引物seqidno：5、，正向引物seqidno：9、反向引物seqidno：7、正向引物seqidno：12、反向引物seqidno：11、正向引物seqidno：、反向引物seqidno：14、正向引物seqidno：、反向引物seqidno：、正向引物seqidno：21、反向引物seqidno：、正向引物seqidno：24、反向引物seqidno：22、正向引物seqidno：27、反向引物seqidno：26、正向引物seqidno：30、反向引物seqidno：28、正向引物seqidno：33、反向引物seqidno：32、正向引物seqidno：36、反向引物seqidno：34、正向引物seqidno：39、反向引物seqidno：38组成引物混合物b。这样，在进行pcr扩增反应时，将含有引物混合物a和引物混合物b的pcr反应体系分别在单管内扩增得到snp-str等位基因特异性复合扩增产物，然后将单管内的扩增产物分别进行毛细管电泳，根据分型标准品进行分型，并用2800m标准dna的扩增产物作为阳性对照，检测分型结果准确与否，若该标准dna分型结果正确，表明该次测序结果可靠。
所述pcr反应体系还包括反应缓冲液，超纯水，allelicladder以及荧光分子量内标，所述反应缓冲液为qiagenmultiplexpcrmastermix（qiagen，国内）。
所述试剂盒的扩增程序为：变性，95℃2min；40个循环，94℃30s，57℃90s，72℃30s；终延伸，70℃60min；4℃保温维持。
进一步的，进行snp-str分型时，为了质量控制使结果更为准确，需要使用标准dna作为阳性对照，使用sdh2o作为阴性对照。因此，本发明试剂盒还包括有标准dna，标准dna可为2800m标准dna；所述试剂盒中还包含分子量内标，其选用橙色荧光标记siz。
本发明具有以下有益效果：
本发明试剂盒包含个snp-str遗传标记，达到了较同位点数str更大的个人识别和亲子鉴定系统效能。通过结合as-pcr和毛细管电泳技术，以进行快速准确的snp-str分型，兼顾了混合样本检测能力并且所用电泳平台已广泛用于生物医学科研机构和公安机关，具有良好的应用前景和推广价值。
附图说明
图1a-b为本发明所述试剂盒等位基因标准物分型图；
图2a-d为本发明检测标准dna2800m的电泳分型图（所用dna量为200pg）；
图3为本发明用于混合样本检测时（混合比1:1000）较少组分dna的检出能力，通过对位点rs2325399-d6s1043单独扩增而举例说明图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明进行详细说明。
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
基于snp-str遗传标记的学复合检测试剂盒，所述试剂盒包括pcr反应体系，所述体系包含扩增以下个dna位点的引物，所述位点具体如表2所示：
表2个dna位点信息
实施例2
本发明的试剂盒已在发明人的实验对四川汉族人群的103个无关个体进行了检测和分型，经过统计学计算，本发明的cdp值为0.999999999999999968、cpe值为0.999998、累积tpi为786032.7、结果表明该试剂盒的分型结果准确，重复性好，可满足实际检案的需要。经过与相同样本的str信息比较，如表4所示，在str基因座相同的情况下，本发明的snp-str复合检测体系显著优于传统的str分型体系。
表4snp-str复合体系与str复合体系的学参数
本发明所述的试剂盒由如下组成：各snp-str位点引物，各50μl；引物混合物，1ml；标准dna2800m，10ng（promega，国内）；pcr反应体系qiagenmultiplexpcrmix2x（qiagen，国内），2ml；sdh2o，1.95ml。
1、操作步骤如下：
1.1扩增体系为：
上述表格中，引物混合物a和引物混合物b按照表1中各引物浓度配制。
扩增程序为：
1.3扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标agcumarkersiz-500组成上样混合物〔(0.5μlagcumarkersiz-500(无锡中德美联生物技术有限公司))×(进样数)+(12μl去离子甲酰胺)×(进样数)〕。将12.5μl上样混合物与本试剂盒中1μl扩增产物或系统中等位基因分析标准allelicladder混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析。
1.4、分型分析用片段分析软件genemapperid2.3分析遗传分析仪检测收集的数据，将样品分析数据和分型标准物(图1)比较。
2、用片段分析软件genemapperid2.3分析步骤中遗传分析仪检测收集的数据，将样品分析数据和等位基因分型标准物的分型结果进行比较，得到实际样品的分型数据。对标准品2800m(promega，美国)梯度稀释至200pg后进行扩增，分型结果如图2示。从图中可以看出，对标准品2800m的检测结果与其基因型一致，分型标准物的分型结果也与各个等位基因的分型一致，30电泳可检出全部基因座分型，这个试剂盒更低可以检出200pgdna模版。
实施例3试剂盒灵敏度检测
应用本发明的试剂盒对扩增dna模板的灵敏度进行检测，分别配制不同浓度的国内基因组dna标准品2800m(1ng、500pg、200pg、100pg、50pg)，按照实施例1中的扩增体系和扩增程序进行扩增检测。检测结果显示：本发明试剂盒的灵敏度可达200pg，且色间峰高的均衡性较好。图2为200pg样本的扩增结果电泳图谱。
实施例4
1、人工模拟混合dna样本检测。
rs2325399-d6s1043g引物对（10μm），1μl；两种用于混合的基因组dna，分别为100pg和100ng；qiagenmultiplexpcrmix2x（qiagen，国内），5μl；sdh2o，1.95ml。
2、扩增体系为
扩增位点rs2325399-d6s1043g的引物对序列为上游引物1seqidno.：cttccataattgtatgagcc、下游引物seqidno.21：taccctaacaagtaactcttc(fam)。
扩增程序为：
3.3扩增产物在遗传分析仪上荧光检测取1μlpcr产物或系统中等位基因分析标准allelicladder，与12μl去离子甲酰胺和0.5μlagcumarkersiz-500(无锡中德美联生物技术有限公司))混合物混匀，95℃变性3分钟，冰浴3分钟，采用遗传分析仪30检测。3.4、分型分析应用genemapperid2.3(lifetech公司，美国)软件分析。对照分型标准物(图1)，分析样品数据。
4、用片段分析软件genemapperid2.3分析步骤中遗传分析仪检测收集的数据，将样品分析数据和等位基因分型标准物的(图1所示)分型结果进行比较，得到实际样品的分型数据。如图3所示，混合dna样本中较少dna的特有基因rs2325399-d6s1043g在1:1000的混合比下仍能得到分型。
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产品与技术 DNA合成
DNA合成方法：
目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有快速、高效的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3’端向6’端合成的，相邻的苷酸通过3’→6’磷酸二酯键连接。
步骤1：将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的苷酸与三氯乙酸反应，脱去其6’-羟基的保护基团DMT，获得游离的6’-羟基；
步骤2：合成DNA的原料，亚磷酰胺保护苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到苷亚磷酸活化中间体，它的3’端被活化，6’-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的6’-羟基发生缩合反应。
步骤3：带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数6’-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
步骤4：在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧苷酸被连接到固相载体的苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的6’-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
我们的产品及服务：
我中心根据客户的不同要求，提供三种不同级别的DNA产品：
1、HPLC纯化
采用高效液相色谱纯化，产物纯度极高，且操作重复性较好，人工原因造成的误差更小，得到的引物质量更为稳定可靠。适用于各种基因工程试验，特别是：PCR克隆，定点突变，人工合成基因，荧光标记DNA、长链DNA等。
2、OPC纯化
OPC纯化是使用一种叫Cartridge的反向析柱,根据析柱中树脂间的亲和力作用的原理进行纯化目的DNA片段和DNA保护基(DMTr基)。OPC法适合纯化较短的引物，推荐仅用于32mer以下引物的纯化，适用于PCR用引物，DNA测序用引物，各种探针等作用。
3、PAGE纯化
PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，对长链OligoDNA(大于50mer)的纯化特别有效。适用于基因克隆用引物，PCR用引物，DNA测序用引物，各种探针等作用。
引 言:本技术规范运用学、遗传学和统计学等学科的理论和技术，结合鉴定的实践经验而制订，为学线粒体DNA检验提供科学依据和统一标准。
鉴定线粒体 DNA 检验规范（SFZ JD0105008-20）
1 范围。本技术规范规定了学DNA实验进行人类线粒体DNA检验的基本要求、检验程序、结果比对与解释、鉴定意见和鉴定文书。
本技术规范适用于学DNA实验采用线粒体DNA遗传标记对母系亲缘关系如母子（女）、隔代外祖母/外孙（女）、舅甥关系、姨甥关系、同母的全同胞或半同胞进行亲缘关系鉴定。
本技术规范适用于学DNA实验对降解严重的毛干、骨、牙等生物检材，在无法获取基因组DNA或基因组DNA量不足而无法完成检测时进行线粒体DNA检测，帮助个体身份信息的确认。
2 规范性引用文件。下列文件对于本文件的应用是不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其更新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GA/T 383-2014 法庭科学DNA实验检验规范
3 术语和定义。下列术语和定义适用于本文件。
3.1 线粒体DNA mitochondrial DNA, mtDNA
人类唯一的细胞外DNA，呈闭环双链结构，约16.5 Kb；不遵循孟德尔遗传定律，表现为母系遗传，通过卵细胞将其中的遗传信息传递给后代；无有丝分裂和减数分裂的周期变化；遗传物质位于细胞器内，不受移植的影响；单个细胞中mtDNA拷贝数多；存在异质性现象。
异质性heteroplasmy
当两种或两种以上的mtDNA序列存在于同一个细胞、组织或个体时称为异质性，可分为长度异质性和点异质性，常见于以下两种情况：（1）个体在同一组织检出不同的mtDNA序列；（2）个体在不同的组织检出不同的mtDNA序列。
3.3高变 hypervariable region, HVR
位于mtDNA非编码的DNA域，突变率可达到单拷贝基因组的6-倍，且无修复系统、不受选择压力的影响，积累了较多的变异，多态性好。
注：也称为控制（control region），或者D-环（D-loop region），可分为高变I（HVR-I）、高变II（HVR-II）和高变III（HVR-III）。
3.4 安德森参考序列Anderson reference sequence, ARS
安德森于81年在英国剑桥Sanger实验首次完成测定的人类线粒体DNA序列，GenBank 登录：M63933、
注1：也被称为剑桥参考序列（cambridge reference sequence，CRS）。
注2：99年，安德鲁斯等人对剑桥参考序列所用的样本进行了重新测序，修正了更初公布序列中的11个碱基序列。修订的剑桥参考序列（revised cambridge reference sequence，rCRS）是目前法庭科学公认的标准参考序列（GenBank 登录：NC_012920.1）。
4 基本要求
4.1 鉴定机构应具有从事的执业范围，且应满足如下要求：
a) 定期参加能力验证相关计划并考合格；
b) 对所有影响鉴定结果的人员岗位规定相应的能力要求，包括教育、资质、培训、专注知识、技能等，并保留相关记录；制定适宜的培训计划并组织实施；
c) 依据鉴定方法和要求对鉴定人以及参与鉴定工作的人员进行监督，以评价其鉴定工作的符合性和满意程度；监督的结果应作为培训需求评价的依据之一；
d) 具有能识别样本的标识系统，并确保样本在鉴定过程期间能得到持续的识别；
e) 建立样本的运输、接收、处置、保护、存储、保留和/或清理的规定，应对接收、内部传递、处置、保留、返还和清理等过程进行记录，确保记录的完整性和可追溯性。
4.2 鉴定人应具有鉴定执业资格，熟悉并掌握线粒体DNA检验的方法和原理，并能正确评价结果。
4.3 鉴定活动应包括检验（采样、DNA提取和纯化、DNA定量分析、mtDNA测序）、结果比对与解释、鉴定意见判断、鉴定文书撰写等环节。鉴定活动完毕后，应将各个环节的记录进行归档。
5 检验程序
5.1 采样要求
5.1.1 毛根、毛干、指甲、陈旧骨骼、牙、DNA检测失败的血痕、组织等生物检材均可考虑检测mtDNA。进行同一母系关系比对时，尽量采集同一种类型的生物检材。
5. 样本应分别包装，注明被鉴定人姓名、编、采样日期等。
5.1.3 样本采集后应冷藏或冷冻保存。
5.1.4 采样单须在案件鉴定完毕后同其他原始技术记录一并存入档案。
5.2 DNA提取和纯化。按照GA/T 383-2014中附录A的方法执行。
5.3 DNA定量分析。按照GA/T 383-2014中6.1~6.3的方法执行。
5.4 mtDNA测序
5.4.1 mtDNA高变测序
可选择商品化mtDNA测序试剂盒（或自行针对HVR域设计的体系）进行PCR扩增和测序。
本规范提供了一个自行针对HVR域设计的体系示例，操作如下：
a) PCR扩增。PCR PCR扩增体系 扩增体系 扩增体系 ：包含 5 μL 10× PCR Buffer、5 μL 25 mmol/L MgCl2、2 μL 10 mmol/L dNTP、10 μL 2.5 μmol/L引物对、0.4 μL Golden Taq酶及1-5 ng DNA，去离子水补足至50 μL 。
HVR-I引物对：L16047：5’-CA T GGG GAA GCA GAT TTG-3’ H16464：5’-TTA GCT ACC CCC AAG TGT-3’
HVR-II引物对：L29L29 :5’ -GGT CTA TCA CCC TAA CCA C-3’ H408：5’ -CTG TTA AAA CAT ACC GCC A-3’
PCR扩增条件： 扩增条件： 扩增条件： 94 ℃，11 min11 min 11 min11 min11 min；94 ℃ 30 s ，55 ℃ 60 s ，72 ℃ 90 s ，35 个循环； 个循环； 72 ℃，7 min。 注:本示例中HVR-I域与HVR-II 域采用相同的PCR扩增体系及扩增条件。
b) 测序。宜采用商品化纯试剂盒（或 其他方法）对 PCR扩增产物进行纯化 ；宜采用商品化测序试剂盒进行测序 PCR反应及毛细管测序电泳 ；用测序软件对收集的电泳数据进行结果分析。
5.4.2 mtDNA全基因组测序。宜选择商品化mtDNA全基因组测序试剂盒（或自行针对mtDNA全基因组设计的体系）进行文库构建、定量、模板制备及测序。操作要求参考相关试剂盒说明书。
5.4.3 质量控制。从事mtDNA测序的实验至少应该包括以下质量控制措施：
5.4.3.1 对照设置。为保证mtDNA测序结果的准确性，要求每次实验过程中均设置阳性对照和阴性对照。阴性对照包括：（1）提取试剂的空白对照，用于监控从提取到分析环节是否存在污染；（2）PCR试剂的空白对照，用于监控从扩增到分析环节是否存在外源DNA污染。
5.4. 双向测序。为避免潜在的异质性影响和保证结果的可靠性，宜进行正、反链双向测序，并至少重复一次。
5.4.3.3 污染防控。mtDNA测序更关键的环节是防止污染。具体防污染措施如下：
a) 实验人员着防护服（如穿一次性实验服），勤换手套、帽子等；
b) 实验工作台在使用前及使用后须彻底清洁，如用漂白剂进行清洁、用紫外线照射实验工作台表面等；有条件的情况下，更好使用超净台进行实验；
c) 实验用移液器、枪头、试剂管等在使用前应进行紫外线消毒；
d) 扩增前和扩增后域应物理隔离；
e) 每次仅处理单个案子的单个样本，证据样本的检测和扩增应优先对照样本进行处理，或在其它单独隔离的实验进行处理；
f) 应建立实验相关人员mtDNA遗传信息的排查数据库。
5.4.3.4 双人操作。序列比对须由两名鉴定人员采用专注比对软件独立完成。
5.4.3.5 线粒体参考人群数据库。实验宜建立mtDNA参考人群数据库，有助于对数据进行质量控制和解释新出现的单倍型序列数据。在尚未建立mtDNA数据库前，可参考遗传学会推荐的线粒体DNA数据库EMPOP（。empop。org）。
6 结果比对与解释
6.1 检测样本与参照样本的测序比对。样本mtDNA序列应与修订的剑桥参考序列rCRS进行比对，结果的表述中需要指明差异位置及比对范围。
原则上，对照样本序列数据用K标示（Known的个英文字母），证据样本序列数据用Q标示（Question的个英文字母），借助比对软件与rCRS进行序列比对。序列比对模式及报告形式见图1、
图1 线粒体序列比对模式及报告形式（A）样本Q和样本K的mtDNA序列与rCRS 的比对；（B）简化为仅报告与rCRS存在差异的报告形式
序列比对的基本原则如下：
a) 运用与参考序列更少数目的差异进行特征分型；
b) 如果不同分析方法比对的结果不一致，应按以下顺序优先考虑差异方式：插入/缺失，转换，颠换；
c) 插入和缺失应放在3'末端（即长度多态性的更末端）。
根据样本和rCRS比对进行分型命名，命名基本原则如下：
a) 与rCRS序列相比，存在单个碱基的差异：如在HVR-II的第73位，rCRS序列为碱基A，检测样本为碱基G，该位点应记录为73G；
b) 与rCRS序列相比，存在碱基插入：先确定插入位置，再记录插入碱基个数及插入碱基。如在第3位和第316位之间存在1个碱基C的插入，应记录为3.1C；
c) 与rCRS序列相比，存在碱基缺失：先确定缺失的位置，再记录缺失碱基信息。如在第523位存在1个碱基A缺失，应记录为523 A-del、523del、523DEL或523-，不能表述为523D或523d；
d) 异质性位点的命名：应按照联盟理论与应用化学代码（IUPAC）进行命名，参见附录A。IUPAC命名均采用大写字母，其中，N仅代表在该位置检见A、G、C、T四种碱基或未检见任何碱基信息。
6.2 异质性的确认。点异质性的确认要求mtDNA测序质量合格，且正反向测序均检测到单个碱基位置上出现了两个碱基。
对于HVR-I和HVR-II多聚C域出现的长度异质性，可以采取2个独立反应对相同单链测序2次，或者采用不同的引物扩增双链，以保证数据质量。其中，在HVR-I域多聚C常位于164 nt-163 nt；在HVR-II域多聚C常位于303 nt-3 nt。
7 鉴定意见
7.1 根据mtDNA检验结果进行鉴定意见判断，一般分为三类：排除、不排除或不确定。
7.2 鉴定意见判断可参考以下原则：
a) 证据样本与对照样本的mtDNA序列相比对，存在两个或两个以上碱基差异（不包括长度异质性），可以排除两样本来自同一个体或同一母系；
b) 证据样本与对照样本的mtDNA序列相同，不排除两样本来自同一个体或同一母系；
c) 证据样本与对照样本的mtDNA存在不同异质性位点信息，不排除两样本来自同一个体或具有母系亲缘关系的两个体；
d) 证据样本与对照样本的mtDNA序列存在一个苷酸差异，且均未检测到异质性，不确定两样本是否来自同一个体或同一母系。
8 鉴定文书
8.1 鉴定人根据检验结果、比对结果和鉴定意见撰写鉴定文书。
8.2 鉴定文书的格式要求宜按照主管部门或鉴定标准化委员会颁布的相关规范执行。
9 特别说明
9.1 建议采取全基因组测序方式建立mtDNA参考人群数据库。
9.2 mtDNA呈单倍型遗传，人类线粒体DNA单倍型类群（human mitochondrial DNA haplogroup）是遗传学上依据mtDNA差异定义出来的单倍群，可用于追溯母系遗传的人类起源。同时，通过单倍群信息分析mtDNA数据，有助于对群体样本数据进行质量控制。可参考单倍群网站如。phylotree。org。
9.3 在学实践中，应充分认识到mtDNA能够提供的信息量有限，如果两份检材的mtDNA经过比对序列一致，只能说明不排除二者来自同一个体或同一母系。
9.4 在学实践中，应充分认识到mtDNA的异质性。异质性违背了同一个体mtDNA序列必然一致的前提条件，给个体识别增加了变数，在作出排除同一性意见时应十分谨慎。在实际鉴定中，如果遇到1个或2个碱基差异，需要考虑异质性存在，条件允许时应提取更多类型的检材进行复查，如果多份检材的异质性出现在同一位置，可增加同一个体认定的可能性。如果在多个位置出现序列的差异，要考虑混合样本或样本污染。
9.5 基于mtDNA存在潜在的突变，对相隔多代的个体进行母系亲缘关系分析时，应谨慎作出判断意见。
附 录 A （资料性附录） IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry)
表A.1给出了联盟理论与应用化学代码（IUPAC）。
表A.1 IUPAC中代码的英文及含义
参 考 文 献
[1] 侯一平。 学[M]。 北京:人民卫生出版社, 2016、
[2] 李成涛, 侯一平等。 英汉遗传学词典[M]。 北京:科学出版社, 2012、
[3] Parson W, Gusmão L, Hares DR, et al。 DNA Commission of the International Society for Forensic Genetics: revised and extended guidelines for mitochondrial DNA typing。[J]。 Forensic Sci Int Genet。 , 2014, (): 4-142
[4] Carracedo A, BÄr W, Lincoln1 P, et al。 DNA Commission of the International Society for Forensic Genetics: guidelines for mitochondrial DNA typing[J]。 Forensic Sci Intl, 2000, (): 79-85
牙釉上海亲子鉴定基因(amelogenin，AMG)
牙釉基因位于X染色体Xp22、编码牙原基质牙釉质蛋白，故名上海亲子鉴定牙釉基因。在
人Y染色体中心粒附近有一类牙釉基因(amelogenin-like AMGL)，与牙釉基因的
碱基序列有90%的同源性。用一对特异性引物可同时扩增AMG和AMGL序列
片段．X特异性片段长977bp，Y特异性片段长788bp。
引物：AMXY-1F 5’-CTG ATG CTT GGC CTC AAG CCT GTG_3,r
AMXY-2F 5’-TAA AGA GAT TCA TTA ACT TGA CTG-3/
扩增后上海亲子鉴定男性可得到977bp和788bp两条带；女性只观察到977bp -条带。此
血痕、过于陈旧血痘的上海亲子鉴定。通过设计引物，缩短引物间距，扩增出更短的片
段，可以克服此类缺点。
1、 微基因检测报告
宏基因检测序列数：直接对提取的全宏基因组DNA建立随机小片段文库，能够获取更多的序列信息。通过组装、ORFs预测与注释，通过各种大型公共数据库进行相应注释，高精度解析微生物群落结构与功能，包括特色的各种抗性基因、可移动元件以及氮循环基因网络分析等。宏基因组测序的优点是：超深度视野，更精确分类定位，真实可靠的功能分析，适合需要更加精确解析微生物群落结构与功能的微生态学分析项目。
2、 微基因取样
可以，因为人的DNA是一条是有两条碱基链互补配对高度螺旋组成的，而这两条碱基一条是来自父方一条是来自母方的，所以母亲和孩子是可以通过验DNA确定血缘关系，也就是我们说的亲子鉴定。
可受理头发,指甲,烟头,牙刷等疑难样本。
母子间的亲子鉴定跟父子间的亲子鉴定是一样的。亲子鉴定遵循孟德尔遗传规律，子女的基因型一半来自父亲，另一个来自母亲。通过说的三联体亲子鉴定就是父母子三人同时参与的亲子鉴定，而二联体亲子鉴定就是指父子或是母子间的亲子鉴定。在鉴定父子关系时，我们需要比对每一个基因位点是否符合遗传规律，同时计算每一个位点的父权指数，并得到累计父权指数来判定父亲与孩子的亲子关系；同样在鉴定母子关系时，我们需要比对每一个基因座位点是否符合遗传规律，同时计算每一个位点的母权指数，并得到累计母权指数来判定母亲与孩子的亲子关系。
3、 微基因示例报告
美国斯坦福分子生物学家帕特里克·布朗（Patrick O。 Brown，54-）似乎对语言有一种悟性；在研究基因时，运用了类似语言学研究的方法，发明了DNA微阵列，大大加快了基因研究的速度。
93年，在机械工程学研究生沙龙帮助下，布朗研制出一个DNA微阵列，成为基因表达变量研究中的创新性工具。这项技术现在已经传遍世界。
99年12月1日，美、英、日等国科学家组成的研究小组宣布，人体第22对染色体基因序列已被破译，对某些疾的早期诊断和治疗有莫大的帮助；是为宏大的人体基因工程的一座里程碑。
4、 单基因检测报告
单靶基因是指编码特定蛋白质的结构基因，它能使转基因生物体产生新的表型。转基因鱼研究中所使用的靶基因大多是生长激素基因、抗冻蛋白基因、珠蛋白基因、金属硫蛋白基因和生长激素释放因子基因等。
5、 基因微环境检测
生物基因检测目前在医学上是比较准的。
现代医学证明，人类的疾是由基因、环境等多因子所引发，例如高血压、糖尿、心血管疾等，但只要预防得当，很多疾完全可以永远不发生，基因检测就可以帮助人们预见并躲过疾。借助基因检测就能及早预测个人患的风险
6、 微基因检测是否真实
D21S11：其为位于21染色体长臂的复杂四苷酸重复。数目可变的TCTA和TCTG重复部分围绕着序列构成为﹛﹝TCTA﹞3TA﹝TCTA﹞3TCA﹝TCTA﹞2TCCA TA﹜长43bp的片段。X.2微变异等位基因主要是源于域3′末端2bp(TA)的插入。D21S11是一个多态性很高的基因座，易于用片段分离方法检测。文献报道该基因座有80多等位基因，多数具有相同长度。多数等位基因具有相同长度，但是一些重复心位置变换导致插入序列结构不同，D21S11等位基因的微小变异结果只能通过测序分析。
例如，4个不同的结构等位基因都被命名为等位基因30、因此，不能仅依靠片段长度分析方法检测。
7、 基因检测报告分析
查询报告的方法：
1、打化验报告电话上面的电话到化验所查询；
2、搜索基因检测中心网址，点击报告查询，输入姓名和证件码（所有资料要与报告上面一致，录入简体或者繁体要和报告上面一致）；
以上关于“TCA检测亲子鉴定”的全部内容了，想要了解更多亲子鉴定相关资讯，请继续关注安康生物。
2023-12-18
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