摘 要：该实验是科研成果转化为实验教学设计的一个成功案例，建立了植物DNA指纹检测和父本鉴定技术。通过本实验，学生可以掌握PCR技术、DNA提取和电泳检测等实验技术，巩固关于基因位点/等位基因、纯合体/杂合体、二倍体/三倍体、孟德尔遗传规律和DNA指纹图谱等多个（对）重要的遗传学概念，提高学生学习遗传学的兴趣。
关键词：遗传标记 遗传学实验 SSR 枣树 分子遗传
Application and practice of SSR marker in the teaching of genetics experiment
Pang Xiaoming， Li Yingyue
Beijing forestry university， Beijing， 100083、 China
Abstract： The well-designed experiment is a successful case of making full use of scientific research achievements in the teaching of genetic experiment， which includes the experiment of DNA fingerprinting construction and paternity analysis of the seedlings。 Through the experiment， the students will have the experience of PCR technology， DNA isolation and the separation of DNA by different methods。 Furthermore， the involvement in the experiment will help to strengthen several important concepts in the genetics including gene locus/allele， heterozygosity/homozygosity， diploid/triploid， the Mendelian inheritance laws and DNA fingerprinting etc。 Taken together， the experiment will be important to invoke the interest to learn the course for the students。
Key words： genetic marker； genetic experiment； SSR； jujube； molecular genetics
“DNA指纹”是指可以利用DNA差异来进行与传统指纹相似的个体身份识别。DNA指纹是以DNA的多态性为基础。SSR（Simple sequence repeat，简单重复序列），又称微卫星DNA，一般是由2～6个苷酸碱基组成的基序并串联而成的DNA序列，在真生物基因组中广泛存在。SSR标记具有多态性高、实验操作简单、稳定性好、可重复性高、对DNA模板质量和数量要求均较低的共显性标记，现广泛应用于亲本分析、遗传多样性研究、指纹图谱和遗传图谱构建等方面，是一种目前发展较为成熟的分子标记技术[1]。
在植物的遗传及育种试验和实践中（如实生选种中），获得的子代苗母本来源是确切知道的，但经常缺乏父本信息。利用共显性分子标记技术结合统计分析方法可以帮助我们寻找可能的父本来源。父本分析（Paternity analysis）对了解群体间或世代间的基因流动及选择适合度有重要的理论意义[2]。SSR的高分辨力及其共显性遗传特点使其成为杂交种亲本鉴定使用更多的标记。
常用的父本分析方法包括排除分析法、更大似然性分析法和父性拆分法等，在植物群体中利用亲本排除法进行父本分析的例子较多[2]。排除分析法根据孟德尔遗传规律检测母本与可疑父本基因型组合能否产生子代基因型，否则排除相应可疑父本。另外，也可以利用软件Cervus 3.0进行分析。Cervus 3.0是一款使用共显性标记的软件，是Marshall于98年开发的，这款软件可以鉴定单亲本未知或双亲本未知的情况，基于更大似然法进行亲本分析，通过等位基因频率来计算各个非排除父本作为亲生父本的概率，进而确定更大可能的父本。用LOD值来进行结果分析。由于便于操作，是目前更普遍应用的亲本分析软件[3]。
该实验是体现遗传学原理和技术在生产和生活中应用的例子，可达到巩固和学习如下重要知识点的目的：（1）通过提取枣树DNA，熟悉植物DNA的提取步骤；（2）巩固分离定律和自由组合定律的学习；（3）巩固PCR技术原理；（4）通过SSR标记的检测，掌握SSR标记的原理、检测技术和应用；（5）通过二倍体和多倍体基因型差异，巩固复等位基因和基因座等概念；（6）学习利用SSR标记进行亲子鉴定的原理和技术。学生通过实验了解到遗传学技术和理论知识可解决生产生活中的具体问题，可有效调动学生学习遗传学知识和技术的兴趣和热情，有助于消除科学研究高不可攀的心理，激发学生对基本实验和科学研究的兴趣，增强学生分析问题和解决问题的能力。
1 实验材料及试剂
1.1 实验材料
冬枣、映山红、赞皇大枣（3n）、梨枣、柿饼枣和辣椒枣及6个不同的杂交后代基因型（已知母本为冬枣，定父本未知）共12个基因型的植物材料。
实验试剂
PCR MIX（北京博迈德科技发展有限公司），6～8对SSR引物，琼脂糖，DNA分子量标准，ddH2O，溴酚蓝加样缓冲液，5×TBE浓贮液〔称取27.5 g硼酸与54 g Tris碱，称量20 ml EDTA（0.5 mol/L），加入蒸馏水定容至1 000 mL，待溶解后温保存待用〕，使用时稀释为0.5×TBE，Goldviewer II（染液）等。
2 实验方法
2.1 实验仪器
微量移液器，小型离心机，恒温水浴锅，PCR仪，电泳仪，紫外透射仪，照相机或（国产凝胶成像系统），枪头和离心管（使用前高温灭菌）。
实验步骤
（1）DNA提取：从我校实验苗圃采集各植物材料叶片，对各样品进行准确编记录，应用CTAB法或试剂盒法提取总DNA。
（2）DNA质量检测：取5μL DNA样品混合1μL 6×Loading Buffer，用0.5×TBE液配制0.8%琼脂糖凝胶对总DNA进行电泳质量检测；取3 μLDNA样品液，在超微量紫外分光光度计上测量其DNA含量（μg/mL）、A260 nm/A280 nm的值及其在260 nm处的吸收峰，检测DNA的纯度，对DNA进行稀释，直至工作浓度10 ng/μL。
（3）SSR-PCR扩增：应用6对SSR引物（见表1）进行PCR反应[4]，引物由北京金唯智生物公司合成。荧光引物为M（-21）-ROX：TGTAAA ACGACGGCCAGT。
表1 SSR引物信息表
20.0 μL PCR反应体系包括：2×PCR MIX（10 μL）、DNA模板（1.0 μL），1?M上游引物（1.0 ul），1?M下游引物（1.0 μL）和ddH2O（7.0 μL）。如果采用毛细管测序电泳检测，则体系中加入1 ?M的M引物 μL。按上述体系混合好后，PCR程序设置如下：94℃ 5min；94℃ 30s-55℃（相应退火温度）30s-72℃ 45s，30个循环；94℃ 30s-53℃ 30s-72℃ 30s，8个循环；72℃ 10min；4℃ forever。
（4）扩增产物检测：扩增结果按照公司提供的手册进行ABI Prism 3730XL型测序仪测序检测，所得数据利用GeneMarker V1.75软件进行读取。或者采用4%琼脂糖凝胶电泳进行检测：用1×TBE液配制70 mL+3.5 μL Goldviewer II；每管加入5 μL溴酚蓝上样缓冲液，瞬时离心取10 μL扩增产物上样；稳压100V，电泳1～1.5 h；UVP凝胶成像系统观察电泳结果并拍照。
2.3 分析结果
图示各品种的基因型，计算相关指标或采用软件分析确定子代的未知父本；当用于检验的位点间非连锁遗传时，每一个位点可以计算出一个父权指数PI（paternity index）值（疑似父亲获得父权的可能性与失去父权可能性的比值，也称为非父排除率），多位点的累积PI值（CPI）等于各位点PI值的乘积，计算公式为：CPI=PI1×PI2×PI3×…×PIn（1，2，3…n代表第1，2，3…n个位点的PI值）。由PI值得到的相对亲权概率RCP=[CPI/（CPI+1）]×100%≥99.73%时，可认为疑似亲本得到父权，RCP
3 实验结果
微卫星位点BFU0277的基因分型峰图如图1所示。分型结果理想，可以较为准确地判断等位基因大小。由图1可知赞皇大枣含三等位基因，验证的基三倍体的特点，其余样品为二倍体。二倍体样品中除梨枣是纯合体以外，其他样品为杂合体。对除赞皇大枣以外的其他个体共分析了8对SSR引物，每个个体的基因型见表2、从表2可以看出，11个个体在这8个基因座的基因型是不一样的，这也构成了分这11个样品的SSR指纹图谱。
图1 12个样品在BFU0277引物中的毛细管电泳检测图
表2 11个样品在8个基因座的SSR基因型
子代1～5的母本为冬枣，通过排除分析法，子代1～4不可能以柿饼枣、辣椒枣或梨枣为父本，因为SSR等位基因遗传违反孟德尔遗传规律，子代出现与这几个疑似亲本完全不同的等位基因位点，排除它们之间有亲缘关系。而映山红不能排除为父本。按照方法中所述公式计算CPI和RCP，结果见表3、可推测映山红为子代1～4的父本。对于子代5、所有的可能父本都被排除，因此在供选材料中没有子代5的父本。而子代6为双亲都未知的个体，通过排除法发现，供选亲本中没有合适的样本可能为其父母本。
表3 4个子代的父本分析指标
由Cervus 3.0软件分析发现，子代1～4的父本为映山红的LOD值见表3，4个LOD值都大于零，与RCP计算结果相一致。对于子代5、所有的可能父本的LOD值都为负值；对于子代6、各种父母本组合的LOD值均为负值。因此，与排除法所得的结果相一致，疑似亲本中没有这两个个体的父（母）本。
4 结束语
本实验为基于课题组更新的科学研究成果设计成的学生容易操作的实验内容，把与实践挂钩的亲子鉴定内容设计到实验中，可以增加学生的学习兴趣[6]。根据实验结果我们看到，本实验涉及基因位点/等位基因、纯合体/杂合体、二倍体/三倍体、孟德尔遗传规律和DNA指纹图谱等多个（对）重要的遗传学概念，使学生能形象地掌握相关概念。
根据学生专注和课时长短的不同，教师可以对实验内容有选择地进行。生物科学和技术类专注课时较长，可以选择用常规的CTAB方法进行DNA提取；而农业和林业等应用性专注学时相对较短，可采用试剂盒进行DNA提取，以节省时间。如果时间和实验经费允许，SSR的产物检测可采用毛细管电泳的方法。而凝胶电泳的方法相对便宜，时间短，而且可以更好地锻炼学生的动手操作能力，有利于学生在实验过程中自信心的培养。
参考文献
[1] Cipriani G， Marrazzo ME， Gaspero G。 A set of microsatellite markers with long core repeat optimized for grape （Vitis spp。） genotyping[J]。 BMC Plant Biology，2008，8：127、
[2] 张冬梅，沈熙环，张华新。林木群体基因流及父本分析的研究进展[J]。林业科学研究，2003，16（4）：488-494、
[3] Kalinowski， ST， Taper， ML & Marshall， TC。 Revising how the puter program CERVUS acmodates genotyping error increases success in paternity assignment[J]。 Molecular Ecology，2007，16：1099-6、
[4] 王斯琪，唐诗哲，孔德仓。利用SSR标记进行枣树子代苗父本鉴定[J]。园艺学报，2012，39（11）：23-2140、
[5] 杨庆恩。亲子鉴定DNA分型亲权指数的简化计算法[J]。国内学杂志，98，（2）：90-92、
[6] 夏曦中，车婧，章志宏。SSR分子标记技术在遗传学实验教学中的应用[J]。实验技术与管理，2012，29（6）：48-50、
1、SSR分子标记的原理
SSR标记又称为sequence tagged microsatellite site,简写为STMS，是目前常用的微卫星标记之一。由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来。由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这一多态性称为简单序列重复长度多态性(SSLP)，每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位。由于SSR重复数目变化很大，所以SSR标记能揭示比RFLP高得多的多态性，这就是SSR标记的原理。
2、奥特兰克战场声望
声望和荣誉是两个截然不同的概念，并且获得方法也不一样！声望是靠完成任务来获得的，当然在有些副本如MC，ZUG。。。通过杀小怪也会获得声望的增长！在大战场（奥特兰），你可以通过做战场里可重复任务来获得声望点，并且可以同时提高其他主城的声望~~~~如果你们赢得了战斗会获得更多的声望。在大战场你的同盟在交任务的时候，你也会获得同样的战场声望，但是你不会获得同等的主城声望。（这就是为什么有那么多的刷子）。如果战场持续的时间长，（去年国庆我经历过2天3夜的），我是人类，有声望速度提高10%，我刷了4场，基本上没下过线，就到了崇拜。其他的种族我就不太了解了。阿拉西，我刷军衔的时候从骑士中尉到骑士队长就到了崇拜。基本上只晚上刷10个小时，固定组刷军衔。大概4-5个晚上吧。阿拉西的声望，基本上进去了拔了旗子就会获得50点，然后出战场交荣誉勋章，又会提高~~~青铜龙声望我们都从仇恨开始，要刷很久才能中立，不过我觉得声望的获得很快，1boss前的小怪每个100点，小怪刷新也快，大概30分钟刷新一组
3、奥特兰克战场声望
声望和荣誉是两个截然不同的概念，并且获得方法也不一样！声望是靠完成任务来获得的，当然在有些副本如MC，ZUG。。。通过杀小怪也会获得声望的增长！在大战场（奥特兰），你可以通过做战场里可重复任务来获得声望点，并且可以同时提高其他主城的声望~~~~如果你们赢得了战斗会获得更多的声望。在大战场你的同盟在交任务的时候，你也会获得同样的战场声望，但是你不会获得同等的主城声望。（这就是为什么有那么多的刷子）。如果战场持续的时间长，（去年国庆我经历过2天3夜的），我是人类，有声望速度提高10%，我刷了4场，基本上没下过线，就到了崇拜。其他的种族我就不太了解了。阿拉西，我刷军衔的时候从骑士中尉到骑士队长就到了崇拜。基本上只晚上刷10个小时，固定组刷军衔。大概4-5个晚上吧。阿拉西的声望，基本上进去了拔了旗子就会获得50点，然后出战场交荣誉勋章，又会提高~~~青铜龙声望我们都从仇恨开始，要刷很久才能中立，不过我觉得声望的获得很快，1boss前的小怪每个100点，小怪刷新也快，大概30分钟刷新一组
4、SSR分子标记的原理
SSR标记又称为sequence tagged microsatellite site,简写为STMS，是目前常用的微卫星标记之一。由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来。由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这一多态性称为简单序列重复长度多态性(SSLP)，每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位。由于SSR重复数目变化很大，所以SSR标记能揭示比RFLP高得多的多态性，这就是SSR标记的原理。
一、采集样本
二、提取DNA
三、PCR扩增
四、电泳分离
五、数据分析
六、结果判断
一、采集样本
亲子鉴定是通过比对DNA序列的相似度来确定亲子关系的一项科技。而要进行亲子鉴定，首先需要采集被测者的样本。
采集样本的方法包括口腔拭子、血液、毛发、指甲等。其中，采用口腔拭子采集唾液样本是更为常见的方法。采集唾液样本不仅无痛苦，而且采集过程简单，不需要专注人员操作，因此被广泛使用。
采集唾液样本的方法是将专门设计的采样棒放入被测者口腔内，让被测者在口腔内来回刮拭，以收集足够的唾液。采集完成后，将采样棒放入保存液中，并标明相关信息，如被测者编、采样日期等。
除了唾液样本外，血液样本也是常用的样本类型。血液样本采集需要专注人员进行，采集完毕后，需要进行抗凝处理，然后进行离心分离得到红细胞和白细胞。白细胞中含有丰富的DNA，是亲子鉴定的理想样本类型。
对于毛发、指甲等样本，采集过程需要将样本放置在无菌的容器中，并进行专门的处理才能提取到足够的DNA。
，采集样本是亲子鉴定的步，样本的质量和数量直接影响到后续的实验结果。因此，采样过程必须严格遵守规范，确保样本的完整性和准确性。
二、提取DNA
亲子鉴定是通过比对被检测人与其亲属之间的DNA序列，来确定亲属关系的一种科学方法。其中，提取DNA是亲子鉴定的关键步骤之一。在DNA提取之前，需要采集被检测人的样本，比如口腔黏膜刮取物、血液、毛发等，然后再进行DNA提取。
DNA提取的目的是将细胞内DNA分离并提取出来，以便后续的PCR扩增和电泳分离。DNA提取的方法有很多种，其中较为常用的是裂解法和蛋白酶K消化法。
裂解法是一种将细胞膜和膜破坏，从而使得DNA裸露在外并被提取出来的方法。常用的裂解剂有SDS、EDTA、蛋白酶等。在进行裂解前，需要先将采集来的样本进行前处理，如血液样本需要进行红细胞裂解等。
蛋白酶K消化法则是通过添加蛋白酶K来消化细胞膜和膜，并使得DNA裸露在外，然后进行提取。该方法具有操作简单、提取效率高的特点，因此在临床亲子鉴定中应用较为广泛。
DNA提取的质量和纯度会直接影响后续的PCR扩增和电泳分离结果。因此，在进行DNA提取时需要注意操作规范、仪器设备的清洁及维护等问题。同时，还需要进行内部对照，以确保结果的准确性和可靠性。
，DNA提取是亲子鉴定过程中至关重要的一步，影响着后续的结果。只有在严格按照操作规程进行，并进行有效的质量控制，才能得到准确、可靠的结果。
三、PCR扩增
PCR扩增是亲子鉴定的心步骤之一，也是更为重要的步骤之一。所谓PCR扩增，指的是通过聚合酶链式反应技术，对DNA进行无数次的复制，以增加检测的敏感性和准确性。
首先，在准备PCR扩增之前，需要对DNA进行提取，并将其纯化。提取DNA的方法有很多，常用的方法是酚氯仿法、盐法、基质法等。其中，酚氯仿法是更为常用的一种方法，具有操作简单、提取效率高等优点。
接下来，将提取出的DNA进行PCR扩增。PCR扩增的步骤主要包括三个部分：变性、退火和延伸。变性是将DNA的双链分离，使其成为单链的过程；退火是让引物与DNA的单链结合形成双链的过程；延伸是以引物为模板，向其补充缺失的碱基，形成DNA的过程。PCR扩增的心在于引物的设计，引物的选择需要根据检测目标的基因序列来进行设计。PCR扩增的反应体系包括引物、酶、缓冲液、模板DNA和水等。
在进行PCR扩增的过程中，需要注意的是反应的温度和时间。通常情况下，PCR反应分为三个阶段：初始变性阶段、循环变性阶段和延伸阶段。其中，初始变性阶段的温度为94℃，时间为2-5分钟，目的是将DNA变性成单链；循环变性阶段的温度为94℃，时间为30s-1min，每次循环都要进行变性；延伸阶段的温度为72℃，时间为1-2min，目的是使引物向DNA模板的3'端延伸。
总的来说，PCR扩增作为亲子鉴定的心步骤之一，需要严格按照操作步骤和条件进行操作，以确保扩增的准确性和可靠性。
四、电泳分离
电泳分离是亲子鉴定中的一个重要步骤，可以帮助我们将扩增出的PCR产物进行分离和鉴定。电泳分离是一种利用电场力作用在带电粒子上的技术，可以将带电分子按大小和电荷的不同进行分离，是生物学、分子生物学和生物化学领域中常用的一种方法。下面我们将详细阐述电泳分离在亲子鉴定中的应用。
1、电泳分离的原理
电泳分离的原理是利用电场力使DNA分子在凝胶中进行迁移，根据分子大小和电荷的不同，DNA分子会在凝胶中形成不同的迁移距离。电泳分离的凝胶通常是琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶，可以根据需要选择不同的凝胶。
2、准备电泳分离实验
在进行电泳分离之前，需要先将PCR产物加入到琼脂糖凝胶中，通常是将PCR产物和琼脂糖混合后在加热溶解，然后将混合液倒入电泳槽中，插入电极并加入电泳缓冲液。在进行电泳分离之前，需要确定电泳条件，包括电流、电压、电泳时间等参数。
3、进行电泳分离
在准备好电泳分离实验之后，将电泳槽连接电源，开启电源并进行电泳分离，通常需要进行数小时的电泳分离，以确保PCR产物在凝胶中充分分离。分离结束后，将凝胶取出并染色，然后在紫外线下观察PCR产物的带型，根据带型可以判断PCR产物的大小和数量，从而判断亲子关系。
4、电泳分离的优缺点
电泳分离在亲子鉴定中是一个非常重要的步骤，具有以下优点：一是可以将PCR产物进行有效的分离，确保鉴定结果的准确性；二是可以根据PCR产物的大小和数量判断亲子关系，对于亲子关系的判断非常重要。但是电泳分离也存在一定的缺点，例如需要较长的电泳时间，不能很好地分一些相似的PCR产物，需要结合其他的亲子鉴定技术进行分析。
5、应用前景
电泳分离在亲子鉴定中具有广泛的应用前景，可以用于鉴定父母子、兄弟姐妹等不同的亲子关系，为、医学等领域提供重要的技术支持。同时，随着亲子鉴定技术的不断发展，电泳分离也在不断完善和改进，未来的应用前景非常广阔。
五、数据分析
数据分析是亲子鉴定的重要步骤之一，其目的是通过对PCR扩增产物进行电泳分离后得到的数据，进行数据处理和比对，从而确定样本之间的亲缘关系。数据分析可以分为两种：定性分析和定量分析。定性分析通过检查样品电泳图像来确定样品是否为同一来源。定量分析可以根据PCR扩增产物的带强度来计算样品之间的相似度和亲缘关系。
在数据分析的过程中，首先需要进行样品的纯化和测序。对于PCR扩增产物的纯化，可以采用凝胶切割、PCR产物纯化试剂盒等方法。测序可以采用Sanger测序、代测序等方法，以获得更加准确的数据。接下来，需要对样品进行电泳分离。电泳分离是将PCR扩增产物按照大小和电荷分离开来，通常采用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳适用于较小的DNA片段，聚丙烯酰胺凝胶电泳适用于较大的DNA片段。
分离完成后，需要对电泳图像进行解读和比对。解读电泳图像可以通过视觉比对、软件处理等方法，来确定样品之间的差异和相似性。比对可以采用多种方法，如SSR分析、SNP分析、STR分析等，以确定样品之间的亲缘关系。在比对的过程中，需要对数据进行统计学分析和计算，在确定亲缘关系时，需要考虑到样品之间的相似度、误差率、基因频率等多个因素。同时，需要进行质量控制，确保结果的准确性和可靠性。
，数据分析是亲子鉴定的关键步骤之一，通过对PCR扩增产物进行电泳分离和数据处理，可以确定样品之间的亲缘关系，为亲子鉴定结果的判断提供科学依据。
六、结果判断
在完成数据分析后，可以得到DNA样本的图谱，形如一个条带。这个条带的个数、长度、强度等信息都是分析的重要依据，通过这些信息，我们可以得到亲子关系的判断结果。
首先，要根据PCR扩增的结果，计算出每个样本的等位基因频率。在这个过程中，需要用到一些统计学方法，例如哈迪-温伯格平衡法、极大似然法等等，这些方法可以让我们更加准确地计算样本的等位基因频率。
接下来，我们需要比较被鉴定人的等位基因频率和潜在亲属的等位基因频率，看看它们是否相似。如果相似，说明被鉴定人和潜在亲属有可能存在亲缘关系；如果不相似，那么就说明他们之间没有亲缘关系。
在进行结果判断时，需要注意以下几点：
1、 判断标准：通常情况下，我们会将等位基因频率的差异定义为一个阈值，只有当两个样本的频率差异小于这个阈值时，才认为它们存在亲缘关系。
2、 确认样本：在进行结果判断时，需要确认每个样本的来源是否正确。如果样本来源不正确，那么得出的结果也就不可靠。
3、 结果解释：结果判断只是一种推测，并不是绝对的事实。因此，在解释结果时，需要充分考虑到样本来源、样本数量、实验过程中的误差等因素，以确保得出的是准确可靠的。
需要指出的是，亲子鉴定只是一种辅助手段，不能代替亲情关系的真实存在。因此，在进行亲子鉴定时，需要遵循科学的精神，客观公正地进行实验，以确保得出的结果是真实可靠的。
以上关于“SSR的亲子鉴定原理”的全部内容了，想要了解更多亲子鉴定相关资讯，请继续关注安康生物。
2023-12-20
匿名咨询
400-025-1120
